收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

BRD7蛋白的抗体制备和其在结直肠癌中的表达及临床意义

林凯东  
【摘要】: [BRD7的研究背景] BRD7是我室新近克隆的鼻咽癌相关基因,是一个含Bromodomain的核转录因子。BRD7基因的过表达可通过调节MAPK及Wnt信号通路抑制鼻咽癌的生长,并将鼻咽癌阻滞在G1/S期。前期研究表明,BRD7不仅在鼻咽癌活检组织中表达下调,RT-PCR结果显示BRD7在结直肠癌细胞中也表现出明显的下调。因此,本文在前期工作基础上,通过制备BRD7抗体,进一步分析BRD7在结直肠癌中的表达及其临床意义。 [GST-BRD7N.融合蛋白的表达与纯化] 从人胎脑文库PCR扩增编码BRD7蛋白N端353个氨基酸的BRD7基因片段,定向克隆到原核表达载体pGEX-4T-1。阳性重组质粒经PCR和测序鉴定,导入大肠杆菌BL21原核表达系统。37℃0.5mM IPTG诱导细菌3.5小时,BL21高效表达预期的64kDa GST-BRD7N融合蛋白。亲和层析纯化后,纯化蛋白的总量超过2 mg/600μl。纯化蛋白的浓度为1.5 mg/ml。在纯化过程中,GST-BRD7N蛋白没有发生降解,保持了完整性。 [抗BRD7多克隆抗体的制备] 用纯化的GST-BRD7N融合蛋白对两只新西兰兔共进行了5次免疫。在初次免疫100天后,收集抗血清,进行亲和纯化。ELISA结果表明,纯化的兔抗BRD7抗体的滴度为1:1,000,000。SDS-PAGE结果显示,两只兔子的BRD7抗体的浓度分别为300μg/ml和150μg/ml。纯化的BRD7抗体特异识别pCMV-Myc-BRD7转染COS7细胞中分子量为75kDa的全长重组融合蛋白Myc-BRD7。为进一步研究BRD7抗体的特异性,我们还进行了免疫沉淀分析。在由BRD7抗体沉淀的免疫复合物中,用c-Myc抗体检测到了Myc-BRD7蛋白的表达。同样,在由c-Myc抗体沉淀的免疫复合物中,用BRD7抗体也检测到了Myc-BRD7蛋白的表达。 [用抗BRD7抗体检测人胚胎组织中BRD7蛋白的组织表达谱] 分别采用Western blot和免疫组化方法,分析了BRD7基因在11种人胚胎组织中的蛋白表达情况。Western blot结果显示,BRD7在大多数所检测人胚胎组织中表达。比较不同组织BRD7蛋白表达水平,BRD7蛋白在小脑、心肌、胰脏相对高表达,在肠、肝、肾中度表达,而在大脑、肺、脾、胃相对低表达。免疫组化实验表明,BRD7蛋白在心肌呈强阳性表达,且主要位于细胞浆,而在小脑、胰、肠、肝、肾、大脑、肺、脾、胃则主要分布在细胞核,其中,小脑、胰、肠、肝、肾为强阳性表达,大脑、肺、脾、胃为弱阳性表达。 [结直肠癌组织微阵列的制作] 成功制作了包括103例原发性结直肠癌病人肿瘤组织和103例配对正常结直肠上皮组织的结直肠癌组织微阵列。每例标本设置3个平行组织点,组织直径0.5mm。组织微阵列切片经HE染色,镜下观察切片质量。结果证实切片厚度适中,细胞形态均一,组织结构无破坏。 [结直肠癌BRD7蛋白表达及其临床意义] 采用高通量的组织芯片和免疫组化技术相结合的方法,对102例结直肠癌组织和99例匹配正常结直肠上皮组织BRD7蛋白的表达水平进行了检测分析。免疫组化阳性的多数样本(75%)BRD7蛋白主要定位分布在胞核。20%样本BRD7蛋白在胞核和胞浆中均有阳性表达。约5%免疫组化阳性样本BRD7蛋白只在胞浆中表达分布。73例(71.6%)结直肠癌和84例(84.9%)配对正常结直肠上皮细胞中BRD7蛋白表达阳性。和配对正常结直肠上皮组织比较,结直肠癌组织样本中BRD7蛋白阳性表达率显著下调(p=0.023)。 进一步分析BRD7蛋白表达水平和结直肠癌临床病理参数之间的关系。发现结直肠癌BRD7蛋白表达缺失与肿瘤大小、Ducks分期、TNM分期、淋巴结转移有关:①肿瘤直径≥4.0cm的病人组织样本中BRD7蛋白阳性表达率明显下调,BRD7蛋白在直径≥4.0 cm肿瘤中阳性表达率为64.8%,而在直径4.0cm肿瘤中BRD7蛋白阳性表达率为87.1%(p=0.031);②结直肠癌Ducks分期中,C期(62.0%)和D期(64.0%)的BRD7蛋白阳性表达率显著低于A期(92.9%)和B期(76.5%)(p=0.041);③TNM分期中,临床Ⅲ期的结直肠癌(64.2%)组织样本中BRD7蛋白阳性表达率明显低于临床Ⅰ期(100%)和临床Ⅱ期(80.0%)(p=0.041);④伴淋巴结转移(62.0%)的结直肠癌组织中BRD7蛋白阳性表达率显著低于无淋巴结转移的结直肠癌组织(80.8%)(p=0.036)。而BRD7蛋白表达水平和结直肠癌分化水平、肿瘤位置、肿瘤远处转移、病人性别以及病人年龄无关(p0.05)。 综上所述,本文首次研究了BRD7基因在结直肠癌组织中的表达及其临床意义。通过构建pGEX-4T-RD7N重组原核表达载体,获得了纯化的原核诱导表达的GST-BRD7N融合蛋白;通过免疫新西兰兔和免疫吸附实验,制备了高效价和高特异性的抗BRD7多克隆抗体,应用该抗体,检测分析了人胚胎BRD7的组织表达谱;借助成功制作的结直肠癌组织微阵列,高通量检测分析了结直肠癌的BRD7表达水平,发现结直肠癌BRD7蛋白表达显著下调,BRD7表达水平与肿瘤大小、Ducks分期、TNM分期、淋巴结转移显著有关。提示BRD7可能在结直肠癌侵袭、淋巴结转移和临床演进中扮演重要角色。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 宋奇思;;综合治疗青年型结直肠癌[J];家庭中医药;2011年07期
2 房静远;戈之铮;高琴琰;王震华;胡靥;;第18届欧洲消化疾病周会议重点介绍[J];胃肠病学;2011年02期
3 刁兴隆;刘丹;金秀琴;;结直肠癌的早期诊断[J];中国农村卫生事业管理;2011年07期
4 李连勇;屈昌民;梁淑文;;微小核糖核酸与结直肠癌的关系研究[J];首都医药;2011年16期
5 胡跃;张苏展;;结直肠癌诊治指南热点解读[J];中国实用外科杂志;2011年06期
6 P.J.Pickhardt;C.Hassan;S.Halligan;R.Marmo;丁静;;CT结肠成像和结肠镜检测结直肠癌的系统回顾与荟萃分析[J];国际医学放射学杂志;2011年04期
7 ;中美共建结直肠癌诊疗国际合作研究所[J];生物医学工程学进展;2011年02期
8 ;上海中山医院预防结直肠癌肝转移成果显著[J];微创医学;2011年05期
9 潘慧娟;周胜杰;;联合检测CEA、CA1999、CA125对结直肠癌的诊断价值[J];医学信息(中旬刊);2011年07期
10 ;补充维生素D有助预防结直肠癌[J];中国社区医师;2011年35期
11 丛进春;沈名扬;冯勇;王俊江;;血清脂联素在结直肠癌中表达的研究[J];中国实用外科杂志;2011年08期
12 肖秀英;于宝华;;PI3K/Akt信号传导通路及其在结直肠癌中的研究进展[J];临床肿瘤学杂志;2011年06期
13 赵娜;;对结直肠癌分期系统的挑战:结直肠癌中转移性淋巴结数目和直肠系膜受累范围的临床意义[J];中国普外基础与临床杂志;2011年07期
14 钱垠;方明治;黄欣;;论湿邪在结直肠癌发病中的作用和地位[J];中国中医药信息杂志;2011年07期
15 金晓燕;雷虹;胡美华;;结直肠癌患者术后化疗期间癌因性疲乏与疾病不确定感的相关性分析[J];护理管理杂志;2011年01期
16 程章林;王国锋;;老年结直肠癌并发急性穿孔5例诊治分析[J];中华实用诊断与治疗杂志;2011年07期
17 姜可伟;刘岩;叶颖江;尹慕军;王有利;谢启伟;杨晓东;曲军;梁斌;王杉;;淋巴结转移度与结直肠癌预后关系研究[J];中国实用外科杂志;2011年06期
18 程跃茹;刘涛;杨正荣;;结直肠癌并发急性肠梗阻的外科治疗[J];安徽医药;2011年10期
19 李旭;黄华;;微小RNA与结直肠癌关系的研究进展[J];国际消化病杂志;2011年03期
20 郭佳凯;赵杨;苏琪;;术中放疗在结直肠癌治疗中的应用现状[J];医学综述;2011年16期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 徐芳英;方义湖;黄琼;来茂德;;微乳头结构和肿瘤芽在结直肠癌发展和预后中的意义[A];中华医学会病理学分会2010年学术年会日程及论文汇编[C];2010年
2 黄彦钦;蔡善荣;张苏展;李其龙;马新源;何玉芳;周晓红;郑树;;中国结直肠癌人群筛查方案的应用价值初探[A];全国肿瘤流行病学和肿瘤病因学学术会议论文集[C];2011年
3 王建平;丁智勇;王颖;;腹腔镜治疗结直肠癌42例体会[A];2011年浙江省肛肠外科学术大会暨结直肠肛门疾病诊治新进展学习班论文汇编[C];2011年
4 潘益峰;张明五;姜侠;张善春;金明娟;马新源;李其龙;余运贤;陈坤;;Toll样受体4基因多态性与结直肠癌易感性的相关性研究[A];全国肿瘤流行病学和肿瘤病因学学术会议论文集[C];2011年
5 王贵玉;陈英罡;刘正;郁雷;汤庆超;马天翼;王锡山;;结直肠癌的临床分期更新意义及相关分子标记物[A];中华医学会肿瘤学分会第七届全国中青年肿瘤学术会议——中华医学会肿瘤学分会“中华肿瘤 明日之星”大型评选活动暨中青年委员全国遴选论文汇编[C];2011年
6 张琪;张宇;裘华森;叶晓峥;魏星;;极高龄结直肠癌患者围手术期处理体会[A];第七届全国中西医结合围手术期医学专题研讨会全国中西医结合围手术期快速康复新进展培训班广东省中医药学会外科学会会议论文集[C];2012年
7 李晓东;殷咏梅;;双调蛋白与表皮调节素在结直肠癌患者血清与肿瘤组织中的表达及两者与临床病理因素的相关性[A];2010’全国肿瘤分子标志及应用学术研讨会暨第五届中国中青年肿瘤专家论坛论文汇编[C];2010年
8 周雷;介建政;宋新;唐弢;王文跃;;结直肠癌肝转移的手术治疗[A];中华医学会肿瘤学分会第七届全国中青年肿瘤学术会议——中华医学会肿瘤学分会“中华肿瘤 明日之星”大型评选活动暨中青年委员全国遴选论文汇编[C];2011年
9 徐玉清;;结直肠癌肝转移治疗原则和进展[A];第九届全国肿瘤转移学术大会暨2011年黑龙江省医学会肿瘤学年会报告集[C];2011年
10 陈嘉;;结直肠癌个体化靶向治疗新理念[A];2010年江苏省抗癌协会第二届传统医学专业委员会学术研讨会资料汇编[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 林凯东;BRD7蛋白的抗体制备和其在结直肠癌中的表达及临床意义[D];中南大学;2010年
2 韩黔峰;sFRP4、β-catenin、Cox-2、ER-β、pS2、Keratin 19蛋白和MSI基因在结直肠癌细胞中的表达[D];四川大学;2005年
3 杨桓;主要乙醇代谢酶编码基因及JWA基因单核苷酸多态性与结直肠癌遗传易感性的关联研究[D];第三军医大学;2009年
4 李天煜;结直肠癌细胞系中表观遗传修饰与p33ING1b基因转录抑制的关系[D];广西医科大学;2010年
5 张继红;Ang/Tie-2在结直肠癌中的表达及其分子机制的研究[D];吉林大学;2011年
6 刘丽;TGFβ信号网络基因遗传变异与结直肠癌发生、发展风险的分子流行病学研究[D];华中科技大学;2011年
7 陈坤;结直肠癌环境与宿主因素的流行病学研究[D];浙江大学;2003年
8 孔斌;水通道蛋白-1(AQP-1)在结直肠癌组织中的表达及其与肿瘤微血管形成的关系研究[D];河北医科大学;2010年
9 解方为;异常甲基化调控结直肠癌细胞Irinotecan代谢酶相关基因的表达及其意义[D];第三军医大学;2009年
10 刘冰;环境因素、Caspase凋亡通路相关基因多态性与结直肠癌风险的关联研究[D];浙江大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王洪敏;结直肠癌肝转移的临床因素分析[D];吉林大学;2010年
2 郭晓亮;REIC/Dkk-3基因在结直肠癌中的表达及其意义[D];中国医科大学;2010年
3 江伟;FOLFIRI方案治疗老年结直肠癌安全性临床观察[D];安徽医科大学;2010年
4 陈尚忠;SOX2在结直肠癌中的表达及意义的初步研究[D];中南大学;2010年
5 石曦雯;核基质结合因子SAFB在结直肠癌发生发展中的作用及其分子机制[D];南方医科大学;2010年
6 龙结根;Testin基因在结直肠癌组织中的表达及临床意义[D];重庆医科大学;2010年
7 廖存;血清CEA阴性结直肠癌患者蛋白组学比较研究[D];广西医科大学;2011年
8 刘金星;MMP-9基因多态性与结直肠癌相关性研究[D];泸州医学院;2011年
9 张丽莉;hMLH1-93G/A基因多态性与结直肠癌的相关性研究[D];南京大学;2011年
10 孟令振;细丝蛋白A在结直肠癌中的表达及其与MMP-9的关联研究[D];河北医科大学;2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 康艾;中国抗癌协会专家云集杭州探讨结直肠癌临床最新进展[N];大众科技报;2010年
2 本报记者 罗朝淑;别让结直肠癌治疗走向“不规”路[N];科技日报;2010年
3 复旦大学肿瘤医院大肠癌外科主任 蔡三军;结直肠癌 治疗理念有更新[N];健康报;2011年
4 记者 田雅婷;结直肠癌有了诊疗规范[N];光明日报;2010年
5 记者 李天舒 通讯员 高健;根治术可提高结直肠癌患者生存率[N];健康报;2010年
6 记者 马艳红;卫生部首次发布《结直肠癌诊疗规范》(2010年版)[N];中国医药报;2010年
7 衣晓峰 董宇翔;结直肠癌临床分期宜更细[N];中国医药报;2011年
8 姜澜;爱必妥可延长结直肠癌肝转移患者生存期[N];中国医药报;2011年
9 记者 白毅;大样本研究揭示结直肠癌发病规律与预后关系[N];中国医药报;2010年
10 张旭;结直肠癌肝转移治疗新途径[N];中国医药报;2011年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978