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卡介菌多糖核酸对小鼠特应性皮炎模型的影响

郭亚南  
【摘要】: 前言 特应性皮炎(AD)是一种常见的瘙痒性皮肤病,通常与过敏性鼻炎和哮喘等过敏性疾病相关。60%的特应性皮炎病例出现在出生后第1年,婴儿期,湿疹样皮损通常开始为颊部红斑和脱屑,抓痕常在数星期后出现,伴随糜烂结痂。儿童期皮损好发于摺缝、项背、以及四肢的伸侧,表现为苔藓化、浸润性斑块。青春期及成人期,苔藓样皮损常影响四肢屈侧、头和颈部。在每一个阶段,都会出现不同程度的瘙痒,夜间加重,从而导致睡眠不足,进而严重影响病人的生活质量。AD病情的严重程度、复发率在不断加剧,引起了广大学者的研究兴趣,但是到目前为止其确切的发病机制还不十分清楚,临床治疗比较棘手。因此研究AD的发病机理及寻找治疗药物是十分必要的。 根据1986年Mosman等提出的细胞分型理论,人类CD4+T细胞按其功能可分为Th1和Th2亚群,Th1/Th2细胞通过分泌不同的细胞因子发挥免疫作用。Th1细胞能产生IL-12, IFN-γ,主要介导细胞免疫及迟发性变态反应,参与细菌或病毒感染的炎症反应。而Th2细胞则分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13,参与以促进嗜酸粒细胞聚集为特征的IgE介导的Ⅰ型变态反应,在过敏或变态反应中起重要作用。正常情况下Th1、Th2产生的细胞因子相互拮抗对方的功能,达到平衡。 越来越多的研究报道表明,AD患者的皮损及血中Th2型细胞因子占优势。IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13水平升高,IFN-γ和IL-12降低,这种细胞因子环境更有利于促进Th2细胞发育,抑制Th1细胞分化。IL-4能促进B细胞分化增殖,是人体内合成IgE并使IgE维持一定浓度的必需细胞因子。IL-12能促进Th1的分化和增殖,促进T细胞、自然杀伤细胞发育与增殖,并刺激这些细胞产生IFN-γ。有学者证实健康者及AD患者中IFN-γ能抑制IL-4介导的IgE产生。随着AD患者临床症状的改善,血浆内IFN-γ的水平上升。由此可见通过调节细胞因子之间的Th1/Th2平衡,抑制Th2优势应答,对治疗AD有重要的意义。 卡介菌多糖核酸(polysaccharide nucleic acid fraction of bacillus calrnette guerin, BCG-PSN)是从卡介菌中经热酚法提取多糖、核酸而制成的新型免疫调节剂,临床研究显示应用BCG-PSN治疗过敏性鼻炎、哮喘、慢性荨麻疹等过敏性疾病取得了满意的疗效。但对于治疗特应性皮炎的基础研究和对树突状细胞的影响尚未见报道。为此,本研究利用NC/Nga小鼠作为AD小鼠模型,观察BCG-PSN对NC/Nga小鼠皮炎严重程度、搔抓频率、耳朵厚度、血浆内IgE、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ蛋白水平和脾脏组织IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γmRNA表达的影响,旨在探讨BCG-PSN对Nc/Nga小鼠皮损的治疗作用及其作用机制。培养小鼠树突状细胞(DC2.4细胞株),观察不同剂量BCG-PSN对小鼠DC2.4细胞形态、细胞膜表面分子MHC-Ⅱ、CD83、CD86蛋白表达、上清液中IL-12、IL-10蛋白水平和DC2.4细胞IL-12、IL-10 mRNA表达的影响;抗TLR2、4、9抗体预处理DC2.4细胞1h后,观察BCG-PSN对DC2.4细胞分泌IL-12蛋白和IL-12p40 mRNA的影响;NF-KB抑制剂PDTC预处理DC2.4细胞1h,观察BCG-PSN对其表面分子DC83、MHC-Ⅱ表达、IL-12分泌以及NF-κB RelB/p50的影响,旨在探讨BCG-PSN对树突状细胞的生物学作用并明确其信号传导通路。通过对新生Nc/Nga小鼠早期多次注射不同剂量的BCG-PSN,观察Nc/Nga小鼠成年后特应性皮炎样皮损、皮炎评分、搔抓频率、外周血血浆IgE的浓度以及脾脏单个核细胞培养上清液中IL-4、IL-12的蛋白水平,观察背部皮损组织病理学变化和免疫组化检测IFN-γ蛋白的表达强度,旨在探讨早期多次注射BCG-PSN对Nc/Nga小鼠特应性皮炎样皮损的预防作用及其可能机制。 目的研究BCG-PSN对特应性皮炎动物模型Nc/Nga小鼠的治疗作用及其可能机制。 方法20只7周龄Nc/Nga雌鼠随机平均分成4组:对照组、模型组、BCG-PSN组、DXM组。皮炎模型建立:鼠龄7周,对照组小鼠足垫及除毛之后腹部外涂丙酮溶液100μl,模型组、BCG-PSN组和DXM组小鼠足垫及除毛之后腹部外涂含5%DNCB的丙酮溶液100μl;鼠龄8-13周,对照组耳朵皮肤外涂丙酮溶液100μl,模型组、BCG-PSN组和DXM组小鼠耳部皮肤涂抹含0.1%DNCB的丙酮溶液100μl,每周1次。给药:对照组和模型组腹腔注射生理盐水100μl,BCG-PSN组按0.5mg/kg腹腔注射BCG/PSN, DXM组按0.1mg/kg腹腔注射DXM,每周1次,共7周。每周计数1次10min内Nc/Nga小鼠搔抓次数并利用游标卡尺测量小鼠耳朵厚度,末次给药后眼球摘除取血、无菌取脾脏,甲醛固定耳部组织,制作石蜡包块。ELISA检测血浆内IgE和IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ的蛋白水平,实时定量rt-PCR检测脾脏组织中IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γmRNA的表达水平,石蜡包块切片行HE染色分析耳部组织皮损炎症程度。 结果(1)各实验组小鼠耳朵皮损及组织病理学变化:对照组小鼠毛发光亮,无明显皮损产生,组织病理示稀疏淋巴细胞浸润,轻度角化。模型组小鼠双侧耳朵出现肿胀、红斑、渗出、表皮剥脱、结痂等表现,皮损组织病理可见角化过度、灶性角化不全、棘层肥厚、轻度海绵水肿、真皮内有大量淋巴细胞伴浆细胞浸润,血管扩张充血。BCG-PSN组红斑、渗出较模型组减轻,皮损组织病理仅表现为轻微角化过度、轻度海绵水肿、真皮浅层少量炎性细胞浸润,DXM组耳朵肿胀较模型组减轻,皮损组织炎症细胞浸润减少。(2)各实验组小鼠耳朵厚度及搔抓行为:模型组小鼠耳朵厚度及搔抓频率与对照组相比,明显增高。BCG-PSN组和DXM组与模型组相比,均可降低DNCB致敏所致小鼠耳朵增厚和搔抓行为,BCG-PSN与DXM之间无差异。(3)与对照组相比,模型组小鼠血浆内IgE、IL-4和IL-10增高,脾脏组织IL-4和IL-10mRNA的表达增高。BCG-PSN可以提高血浆内IL-12和IFN-γ蛋白浓度和脾脏组织IL-12p40和IFN-γmRNA的表达,抑制Nc/Nga小鼠血浆内IgE的水平。DXM可降低血浆内IgE水平,增加IL-10的含量,减少IL-4、IL-12、IFN-γ表达。 结论我们外用DNCB致敏Nc/Nga小鼠成功建立小鼠特应性皮炎模型;BCG-PSN主要通过降低IgE水平、增加IL-12和IFN-γ,对Nc/Nga小鼠特应性皮炎样皮损产生抑制作用。 目的研究BCG-PSN对小鼠树突状细胞(DC2.4细胞株)分泌细胞因子IL-10、IL-12和细胞表面MHC-Ⅱ、CD83、CD86蛋白表达的影响。 方法用终浓度5μg/ml、20μg/ml、50μg/ml BCG-PSN刺激小鼠DC2.4细胞,48h后倒置显微镜观察细胞形态,流式细胞仪检测主要组织相容性复合物类分子(MHC-Ⅱ)及协同刺激分子CD83、CD86蛋白表达水平,ELISA方法检测上清液中IL-12、IL-10的蛋白含量,实时定量RT-PCR测定IL-10、IL-12p40 mRNA的表达情况;抗TLR2、TLR4、TLR9抗体分别预处理DC2.4细胞1h后,ELISA方法检测培养细胞上清液中IL-12的蛋白含量,实时定量RT-PCR测定IL-12p40mRNA的表达情况;PDTC预处理DC2.4细胞1h,观察BCG-PSN对其表面分子DC83、MHC-Ⅱ表达及IL-12分泌的影响,并检测NF-κBRelB/p50的活性。 结果不同浓度BCG-PSN与DC2.4细胞共同培育后,细胞体积增大。细胞突触增粗并随BCG-PSN浓度增高而增多;5μg/ml、20μg/ml、50μg/ml BCG-PSN组DC2.4细胞表面共刺激分子CD83和组织相容性复合物MHC-Ⅱ分子表达水平高于空白对照组(P0.05),CD86在各组细胞均为高度表达,组间无统计学差异。DC2.4细胞培养上清液中IL-12随BCG-PSN浓度的增加而增加,与对照组相比,有统计学意义,BCG-PSN可以促进IL-12p40 mRNA表达,呈剂量依赖性。抗TLR4抗体预处理后,IL-12分泌和IL-12p40 mRNA表达减少,与对照组相比没有统计学差异,抗TLR2或抗TLR9抗体预处理对BCG-PSN的作用没有影响。PDTC预处理DC2.4细胞,可以阻断BCG-PSN促DC2.4细胞IL-12p40基因转录的作用,培养细胞上清液中IL-12的含量没有增加。 结论BCG-PSN可促进DC2.4细胞CD83、MHC-Ⅱ的表达,增加IL-12的分泌;DC2.4细胞通过TLR4受体识别BCG-PSN,继而激活NF-κB,从而促进IL-12p40基因转录。 目的研究早期多次注射BCG-PSN对Nc/Nga小鼠特应性皮炎样皮损的预防作用并探讨其可能的机制。 方法新生Nc/Nga小鼠随机分为3组:对照组(n=4)、0.1mg/kg BCG-PSN组(n=5)、0.5mg/kg BCG-PSN组(n=7)。BCG-PSN各组在出生后第1、8、15、22天分别皮下注射0.1mg/kg和0.5mg/kg的BCG-PSN,对照组以等量的生理盐水代替;鼠龄第48天,8%的硫化钠脱去背部鼠毛;鼠龄第49天,用1%DNCB致敏小鼠,鼠龄第56、63、70天外用0.1%DNCB进行激发;第57、64、71天进行皮炎评分拍照、眶后静脉采血、观察并记录搔抓行为,第72天处死小鼠并收集血浆、脾脏和背部皮损组织。ELISA方法检测血浆中IgE的浓度和脾脏单个核细胞培养上清液中IL-4和IL-12的浓度,免疫组化观察皮损中IFN-γ的表达,HE染色观察皮损组织病理学改变。 结果早期重复注射BCG-PSN,可以显著改善DNCB致敏Nc/Nga小鼠皮损炎症程度,降低皮炎评分以及小鼠的搔抓行为,不同剂量BCG-PSN组之间搔抓频率无差异。BCG-PSN可以降低血浆中IgE的含量,呈剂量依赖性。0.5mg/kgBCG-PSN可增加皮损中分泌IFN-γ的细胞数量。不同剂量BCG-PSN均可降低脾单个核细胞培养上清液中IL-4的含量,增加IL-12的浓度。 结论早期注射BCG-PSN可通过促进分泌IFN-γ细胞的增生,增加IL-12合成,降低IL-4和IgE的含量,从而有效减轻Nc/Nga小鼠皮炎严重程度。


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