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EphA2基因沉默对胃癌SGC-7901细胞侵袭力的影响及相关机制研究

袁伟杰  
【摘要】: 背景:胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。尽管近年来外科技术的进步和采用包括化疗、放疗在内的多种治疗手段,但世界范围内进展期胃癌的5年生存率仍不超过25%。肿瘤侵袭转移、术后复发是胃癌患者主要的死亡原因,也是影响临床治疗和预后的关键因素,因此研究胃癌发展、侵袭转移的机制具有十分重要的意义。受体酪氨酸激酶(RTKs)在调控肿瘤细胞生长、增殖、转移的相关信号转导通路中起关键作用。人肝细胞生促红素(Eph)基因家族是目前已知RTK中最大的亚族,具有受体酪氨酸激酶的活性,能将外界刺激信息传递至细胞核并转化成细胞效应的信号通路的关键组成部分。其中EphA2受体是已发现的14种Eph受体中的一员,其基因位于被认为是肿瘤“热点”的染色体1p36.1。EphA2在许多肿瘤中呈高表达和高活性,且与肿瘤的转移和患者的预后密切相关。过表达的EphA2能增强肿瘤细胞向外侵袭和转移的能力,但是EphA2促进肿瘤侵袭具体的作用机制目前仍不十分清楚。MMP-9是基质金属蛋白酶家族中重要成员,属于明胶酶,能降解细胞外基质主要成分。目前MMP-9被认为是肿瘤侵袭转移过程中最直接、最重要的金属蛋白酶。研究表明通过检测肝细胞癌和卵巢癌组织中EphA2与MMP-9的表达两者存在正相关性,但是EphA2是否通过MMP-9在肿瘤侵袭转移过程的发挥作用至今未见相关报道。 目的:探讨EphA2在胃癌侵袭过程中的作用及其可能机制。 方法: 1.采用免疫组织化学法检测97例胃癌组织和24例正常胃粘膜组织中EphA2和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白的表达情况,分析胃癌组织中EphA2和MMP-9的表达与临床病理因素及预后之间的关系。 2.构建特异性EphA2 siRNA表达载体,并借助脂质体将其转入胃癌SGC-7901细胞。实验分为空白对照组(未转染的胃癌细胞)、阴性对照组(阴性质粒转染的胃癌细胞)和EphA2 siRNA组(EphA2 siRNA质粒转染的胃癌细胞)。用实时定量逆转录聚合酶链式反应(real time RT-PCR)检测EphA2 mRNA表达变化,western blot检测EphA2蛋白表达变化,噻唑蓝法(MTT)观察细胞生长,流式细胞仪检测细胞周期,transwell侵袭实验观察细胞迁移和侵袭情况,并用real time RT-PCR和western blot检测MMP-9表达。 3.建立裸鼠皮下胃癌SGC-7901细胞移植瘤模型后,18只裸鼠随机分成三组:空白对照组(生理盐水瘤内注射)、阴性对照组(阴性对照质粒+脂质体瘤内注射)和EphA2 siRNA组(EphA2 siRNA质粒+脂质体瘤内注射),以上处理隔天一次,共6次。每周定期测量不同处理组裸鼠皮下移植瘤体积,第一次治疗后第21天处死裸鼠并测量瘤体重量,并用免疫组织化学法检测移植瘤EphA2和MMP-9蛋白的表达。 结果: 1.与正常胃粘膜组织相比,胃癌组织中EphA2和MMP-9呈强表达(P0.01);胃癌组织中EphA2和MMP-9蛋白强弱表达均与胃癌的大小、浸润深度、肿瘤TNM分期以及淋巴结转移数目有关(P0.05),并且MMP-9蛋白表达与肿瘤分化程度有关(P=0.029);胃癌组织中EphA2和MMP-9蛋白表达呈正相关(r=0.732,P0.01);单因素分析EphA2蛋白强表达组5年生存率明显低于弱表达组(P=0.037),并且MMP-9蛋白强表达组5年生存率与弱表达组比较差异有统计学意义(P=0.019);Cox多因素分析结果发现EphA2和MMP-9蛋白强弱表达是影响预后的独立因素。 2.成功构建了EphA2 siRNA表达载体并且能高效转入SGC-7901细胞内。与阴性对照组比较,EphA2 siRNA组中EphA2 mRNA和蛋白表达沉默效率分别达到了73.4%和65.1%(P0.01);与空白对照组和阴性对照组比较,EphA2 siRNA组中细胞生长受到明显抑制(P0.01),同时细胞周期分布存在明显差异,其中G0/G1期比例增高(P0.01),而S期和G2/M期比例降低(P0.05),细胞的增殖指数亦明显降低(P0.01),细胞的迁移和侵袭能力下降(P0.01);同时EphA2 siRNA组中MMP-9 mRNA和蛋白的表达也均显著下降(P0.01)。 3.成功建立胃癌SGC-7901细胞裸鼠皮下移植瘤模型,EphA2 siRNA组移植瘤体积和瘤体重量均较空白对照组和阴性对照组下降(P<0.01),第一次治疗后第21天EphA2 siRNA组体积抑瘤率达47.5%。空白对照组和阴性对照组中EphA2和MMP-9蛋白的表达均高于EphA2 siRNA组。 结论 1.胃癌组织中EphA2和MMP-9的高表达不仅与胃癌的发展和转移密切相关,也可作为判断胃癌患者预后的指标之一 2. EphA2 siRNA表达载体能有效抑制胃癌SGC-7901细胞EphA2 mRNA及蛋白的表达。沉默EphA2在胃癌SGC-7901细胞中的表达可抑制SGC-7901细胞生长、增殖、迁移和侵袭以及MMP-9的表达。 3.裸鼠移植瘤瘤内注射EphA2 siRNA能抑制移植瘤生长和侵袭,同时也抑制其EphA2和MMP-9蛋白表达。


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