大鼠骨髓间充质干细胞对梗死后心肌中成纤维细胞转型的调控及其机制的研究

【摘要】： 目的： 观察大鼠骨髓间充质干细胞对梗死后心肌中成纤维细胞转型的调控,并探讨其可能机制。研究方法： 1.体外分离、培养、扩增、鉴定SD大鼠MSCs,并选择最佳分离培养MSCs的方法：(1)采用现行两种主要分离培养MSCs的方法：密度梯度离心法、全骨髓贴壁法分离培养MSCs,并对全骨髓贴壁法加以改进,选择MSCs培养生长增殖状态最佳的培养方法来培养实验用MSCs;(2)使用流式细胞仪技术检测MSCs表面两种抗原分子的表达情况：CD29、CD45;(3)加入成骨、成脂肪诱导分化培养体系,观察MSCs向成骨细胞、成脂肪细胞分化的能力,以鉴定其多向分化潜能；(4)采用Brdu标记法标记移植用细胞,并检测其细胞活力。 2.大鼠心梗模型的制作及心律失常至造模失败分析、心肌匀浆的制作：(1)采用开胸直视下结扎左前降支的方法制作大鼠急性心肌梗死模型；(2)分析早期心律失常至造模失败机制,并加以预防改进；(3)心梗后心肌匀浆制作：使用组织匀浆机研磨心肌组织块,取匀浆上清并过滤除菌。 3.体外模拟心梗后微环境,单培养及和培养MSCs与心肌成纤维细胞,观察两种细胞的转化情况：(1)使用心梗后心肌匀浆加入培养基,模拟心梗后微环境；(2)单培养或和培养两种细胞,应用细胞免疫化学染色的方法观察两种细胞的转化情况；(3)应用ELASA法检测培养基质中TGF-β1、TNF-α、PDGF的浓度变化。 4.体内实验：大鼠心梗模型建模14天后,对大鼠心脏心梗周边区多点分别注射含TGF-β1 150μLDMEM培养液(n=13), PBS150μL (n=13),5×106MSCs/150μL(n=13)。移植后一月,处死大鼠,获取心脏标本,采用组织病理、免疫组化的方法鉴定移植部位有无肌纤维母细胞的聚集,并采用westen-blot、PCR分析胶原蛋白的产生情况。 结果： 1.全骨髓贴壁法组MSCs传代、生长速度明显快于密度梯度离心法法组MSCs,两组细胞流式细胞仪鉴定、分化能力鉴定及细胞活力均符合实验要求； 2.青年组大鼠心律失常、室颤及早期死亡率均明显低于中年组大鼠,心律失常发生率与两组大鼠血清NE值增加速度成正比； 3.利多卡因术前腹腔注射后,早期心律失常发生率下降,早期造模成功率升高； 4.差速贴壁法可以分离培养的第二代成纤维细胞,MSCs与心脏成纤维细胞共培养,加用心梗14天后心梗周边区域心肌匀浆干预7-28天后行平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫细胞化学染色呈阳性,ELASA法检测到急性心梗后14天心梗周边去心肌匀浆干预MSCs单培养组、MSCs与心脏成纤维细胞共培养组细胞因子TGF-β1浓度明显高于其他组,且与肌纤维母细胞阳性率正相关； 5、MSCs移植组的梗死心肌内存在大量BrdU标记阳性的移植细胞,Brdu阳性区连续切片行波形蛋白及平滑肌肌动蛋白免疫组化染色阳性,Brdu阴性区连续切片行平滑肌肌动蛋白免疫组化染色阴性；移植后MSCs移植区、TGF-β1注射区、PBS注射区胶原蛋白Ⅰ、ⅢmRNA及蛋白的表达,PBS注射区明显小于MSCs移植区、TGF-β1注射区胶原蛋白Ⅰ、ⅢmRNA及蛋白的表达。 结论： 1.全骨髓贴壁法组MSCs生长增殖速度明显快于密度梯度离心法法组MSCs,并符合实验使用要求； 2.开胸直视结扎左前降支能有效制作大鼠急性心肌梗死模型,其早期心律失常至造模失败率与血清NE值升高速度正相关,术前腹腔注射利多卡因能提高造模成功率； 3.差速贴壁法可分离培养出心脏成纤维母细胞,急性心梗后14天心梗周边去心肌匀浆干预MSCs与心脏成纤维细胞共培养组细胞7-28天后可形成肌纤维母细胞,并由成纤维细胞转化而来,急性心梗后14天心梗周边去心肌匀浆干预MSCs(无论单培养还是与成纤维细胞共培养)可分泌一定量的细胞因子TGF-β1,TGF-β1参与成纤维细胞向肌纤维母细胞的转型； 4.大鼠心脏对移植MSCs无明显免疫排斥,移植MSCs14天后,MSCs仍存活于心脏,MSCs移植区有肌纤维母细胞的聚集,MSCs移植能促进移植区胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ的分泌,TGF-β1可能参与其中,体内实验验证了体外实验关于MSCs通过分泌TGF-β1调控心肌内成纤维细胞向肌纤维母细胞转型的结论。