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紫杉醇对TNF-a诱导内皮细胞中Cat K表达的影响及机制

张良  
【摘要】: 第一章紫杉醇对新西兰大白兔髂动脉球囊损伤后新生内膜形成和Cat K表达的影响 背景 经皮腔内冠状动脉血管成形术(PTCA)是冠心病治疗的一种重要方法,但是大约20%-40%的患者在术后6个月出现血管内再狭窄。新生内膜形成在血管成形术后再狭窄的发生中起着重要作用。组织蛋白酶K能降解细胞外基质,促进VSMC和EC迁移,与内膜增生密切相关。紫杉醇可抑制VSMC和EC的增殖及迁移,能防治支架内再狭窄。紫杉醇是否通过抑制组织蛋白酶K表达来减少新生内膜形成目前不是很清楚。 目的 观察紫杉醇对兔髂动脉球囊损伤后新生内膜形成和Cat K及NF-KB表达的影响,探讨紫杉醇减轻血管球囊损伤后新生内膜形成的机制。 方法 40只雄性新西兰大白兔,随机分为正常对照组(n=8)、手术组(n=16)和紫杉醇组(n=16),均予普通饮食。手术组和紫杉醇组行右侧髂动脉球囊损伤,紫杉醇组术后在喂食普通饲料的基础上予腹腔注射紫杉醇2mg/kg,持续7天或14天。对照组和手术组每日均腹腔注射相同体积的生理盐水。各组分别在术前1天,术后1天,术后第7天和第28天处死兔子时采血。用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清TNF-a变化。动物喂养在术后第7天和第28天处死兔子,取右侧髂动脉行病理形态学检测,用RT-PCR、Western-blotting和免疫组化方法测定血管中Cat K的表达,用Western-blotting和免疫组化方法检测NF-KB表达。 结果 1.术前三组血清TNF-a水平无明显差异。手术组术后第1天、第7天和第28天血清TNF-a水平分别为17.92±3.71,23.65±4.51和19.73±3.83ng/l,较术前12.97±2.24 ng/l明显升高,P0.01。但同一时间点紫杉醇组与手术组TNF-a水平差别不是很明显,术后第7天TNF-a浓度最高。 2.与正常对照组相比,手术组和紫杉醇组内膜面积和内膜/中膜面积(I/M)明显增加;手术组术后7天,28天内膜面积和内膜与中膜面积比分别为0.19±0.05mm2,0.35±0.11和0.69±0.1lmm2,1.39±0.13,两者相比,P0.01。随着术后时间的延长,手术组和紫杉醇组内膜面积和内膜/中膜面积(I/M)明显增加,紫杉醇组内膜面积和内膜/中膜面积(I/M)比手术组同一时间点减少,三组中膜面积在这两个时间点无显著性差异,P0.05。 3.正常对照组基本无Cat K mRNA表达,手术组Cat K mRNA和紫杉醇组Cat K mRNA明显增加,紫杉醇组术后7天,28天Cat K mRNA表达分别为0.559±0.055和0.786±0.025,两者相比,P0.01。且随着术后时间延长,Cat K mRNA表达增加,与紫杉醇组(0.786±0.025)相比,同一时间点手术组Cat K mRNA表达(0.880±0.065)明显增多,P0.05。 4.正常对照组无明显Cat K蛋白的表达,手术组和紫杉醇组均有Cat K表达,手术组术后7天,28天Cat K表达分别为0.421±0.05和0.819±0.10,两者相比,P0.01。且随着术后时间延长,Cat K表达增加,与手术组(0.819±0.10)相比,同一时间点紫杉醇组Cat K表达(0.632±0.06)低于同期的手术组,P0.05。 5.免疫组化分析,正常对照组无明显Cat K阳性蛋白的表达,手术组Cat K和紫杉醇组Cat K阳性表达明显增加,且随着术后时间延长,Cat K阳性表达增加,与手术组(16.13±1.27)相比,同一时间点紫杉醇组Cat K免疫组化评分(12.46±1.53)明显减少,P0.05。 6.正常对照组基本无明显NF-KB蛋白的表达,手术组NF-KB和紫杉醇组NF-KB明显增加,且随着术后时间延长,NF-KB表达增加,与手术组(0.369±0.04)相比,同一时间点紫杉醇组NF-KB表达(0.241±0.03)明显减少,P0.05。 7.免疫组化分析,正常对照组无明显NF-KB阳性蛋白的表达,手术组NF-KB和紫杉醇组NF-KB阳性表达明显增加,手术组第7天和28天免疫组化评分分别为4.75±0.79和14.29±1.36,两者相比,P0.01。且随着术后时间延长,NF-KB阳性表达增加,与紫杉醇组免疫组化评分为(11.37±1.45),低于同一时间点手术组NF-KB免疫组化评分(14.29±1.36),P0.05。 结论 新西兰大白兔髂动脉球囊损伤后新生内膜明显增厚,内膜Cat K和NF-KB表达均明显增加,且随着术后时间的延长增加越多。紫杉醇可能通过抑制NF-KB活性减少Cat K表达,减轻髂动脉球囊损伤后新生内膜形成。血清TNF-a水平在兔髂动脉球囊损伤后升高,与在兔血管壁中Cat K表达可能无直接关系。 第二章TNF-a对人脐静脉内皮细胞中Cat K表达的影响及其信号通道机制 背景 肿瘤坏死因子-a(TNF-a)是一种重要的促炎症因子,可以调控多种炎症因子和生长因子的表达。TNF-a在血管球囊损伤后的新生内膜中表达增加。血管损伤时导致多种炎症因子和细胞因子被激活,这些因子相互作用加重了血管壁的炎症反应,促进了新生内膜的形成。组织蛋白酶K能降解细胞外基质,促进VSMC和EC迁移,与内膜增生密切相关。TNF-a可以促进血管内皮细胞中Cat K的表达,但是两者之间的时效和量效关系尚不十分清楚。在人的内皮细胞中TNF-a通过哪些信号通道促进Cat K的表达,也不是很清楚。 目的 观察TNF-a不同浓度和不同作用时间对人脐静脉内皮细胞中CatK表达的影响,以及不同信号通道阻滞剂对TNF-a引起Cat K表达的抑制作用,探讨TNF-a影响Cat K表达的机制。 方法 采用HUVEC细胞株传代3-6代时处于对数生长期的细胞作为研究对象。细胞中加入不同浓度的TNF-a作用24h或者加入10ng/ml的TNF-a作用不同时间。在HUVEC中加入10ng/ml的TNF-a,并分别加入特异性的P38MAPK信号通道阻滞剂SB203580、PI3K信号通道阻滞剂LY294002和NF-kB通道阻滞剂PDTC作用24h。用RT-PCR方法和western-blotting方法检测细胞中的Cat K mRNA和蛋白的表达。 结果 1.正常对照组HUVEC未见明显Cat K mRNA表达。随着TNF-a浓度的增加,Cat K mRNA的表达越来越强,0.1ng/ml,1ng/ml和lOng/ml TNF-a组Cat K mRNA表达分别为0.27±0.03,0.39±0.04和0.50±0.04,两两相比,均P0.01。1Ong/mlTNF-a组Cat K mRNA表达最强,1OOng/mlTNF-a组Cat K mRNA表达为0.44±0.06,较1Ong/mlTNF-a组反而下降,P0.05。 2.随着TNF-a浓度的增加,Cat K的表达越来越强,0.1ng/ml,1ng/ml和lOng/ml TNF-a组Cat K表达分别为1.12±0.13,1.55±0.11和1.94±0.10,两两相比,均P0.05。1Ong/mlTNF-a组Cat K表达最强,l00ng/mlTNF-a组Cat K表达(1.36±0.56)较1Ong/mlTNF-a组表达减少,P0.05。 3.予lOng/ml TNF-a作用不同时间后,HUVEC可见Cat K mRNA明显表达,TNF-a干预时间6h,12h和24h时Cat K mRNA表达分别为0.37±0.04,0.59±0.06和0.69±0.04,两两相比,均P0.01。从6h到24h时,随着TNF-a干预时间的增加,Cat K mRNA的表达越来越强。Cat K mRNA表达在TNF-a24h组最强,TNF-a48h组Cat K mRNA表达(0.61±0.07)较TNF-a24h组明显下降,P0.05。 4. TNF-a干预时间6h,12h和24h时Cat K表达分别为0.36±0.04,0.54±0.05和0.84±0.07,两两相比,均P0.05,予lOng/ml TNF-a作用从6h到24h时,随着TNF-a干预时间的增加,Cat K的表达越来越强。TNF-a48h组Cat K表达为0.60±0.07,较TNF-a24h组明显减少,P0.05。 5. HUVEC在lOng/ml TNF-a刺激基础上分别加入SB203580、LY294002和PDTC作用24h后,细胞中Cat K mRNA表达分别为0.55±0.04,0.57±0.01和0.52±0.04,较lOng/ml TNF-a组(0.65±0.04)时均明显下降,P0.05。 6. HUVEC在10ng/mlTNF-a刺激基础上分别加入SB203580、LY294002和PDTC作用24h后,细胞中Cat K表达为0.70±0.08,0.67±0.11和0.62±0.09,较10ng/mlTNF-a组(0.91±0.15)时均明显下降,P0.01。 结论 TNF-a可以呈剂量和时间依赖性刺激HUVEC中Cat K表达:TNF-a可能通过激活P38、PI3K和转录因子NF-KB信号通路促进HUVEC中Cat K表达。 第三章紫杉醇对TNF-a诱导人脐静脉内皮细胞中Cat K表达的影响 背景 完整内膜在防止血栓形成和再狭窄发生中起重要作用,延迟血栓形成和延迟再狭窄发生可能与紫杉醇抑制内皮再生有关。组织蛋白酶K能降解ECM的多种成分,促进VSMC和EC迁移,与内膜增生密切相关。NF-kB是一个重要的转录因子,可以调控多种基因产物的表达。紫杉醇有明显抑制细胞迁移的作用,紫杉醇对组织蛋白酶K表达的影响目前尚无研究。紫杉醇能否通过抑制内皮细胞中NF-kB表达来减少Cat K表达,目前尚不清楚。 目的 观察紫杉醇对TNF-a诱导人脐静脉内皮细胞中Cat K及NF-kB表达的影响,探讨紫杉醇在防治内膜增生的作用机制。 方法 采用HUVEC细胞株传代3-6代时处于对数生长期的细胞作为研究对象。用10ng/mlTNF-a刺激人脐静脉内皮细胞中的Cat K的表达,并分别加入不同浓度的紫杉醇干预24小时,用RT-PCR方法检测细胞中Cat K mRNA的表达;用western-blotting方法检测细胞中的CatK和NF-kB蛋白的表达。 结果 1.1nmol/l,10nmol/l,100nmol/l和1μml/l紫杉醇干预组Cat K mRNA的表达分别为0.85±0.06,0.68±0.04,0.59±0.02和0.49±0.03,两两相比,均P0.05,均较TNF-a组(1.02±0.07)表达减少,均P0.05。紫杉醇可以呈剂量依赖性地抑制TNF-a所致的HUVEC中Cat K mRNA的表达,紫杉醇浓度越高,抑制Cat K mRNA的表达越强。 2.1nmol/l紫杉醇组和TNF-a组中Cat K表达分别为1.08±0.07和0.87±0.03,两者相比,P0.05。紫杉醇可以呈剂量依赖性地抑制TNF-a所致的HUVEC中Cat K蛋白的表达,紫杉醇浓度越高,细胞中CatK的表达越少。 3.正常对照组未见明显NF-kB的表达,1nmol/l紫杉醇组和TNF-a组中NF-kB表达分别为0.93±0.04和0.87±0.07,两者相比,P0.05。紫杉醇可以呈剂量依赖性地抑制TNF-a所致的HUVEC中NF-kB蛋白的表达。紫杉醇浓度越高,细胞中NF-kB的表达越少。 结论 紫杉醇可以呈剂量依赖性地抑制TNF-a所致的HUVEC中Cat K和NF-kB的表达,紫杉醇可能通过抑制NF-kB活性使Cat K表达减少。


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