肝卵圆细胞移植治疗肝纤维化与肝功能不全的实验研究

【摘要】： 目的：建立一种稳定而确实可靠的肝卵圆细胞分离方法,为后续的实验研究奠定基础。 方法：参照Bryon等的报道,利用携带GFP(绿色荧光蛋白)转基因C57BL/6小鼠12只,2只作为空白对照,10只喂以含浓度为0.1%的3,5-二乙酯基-1,4二氢三甲基毗啶(DDC),刺激卵圆细胞的增生。而后利用两步酶灌注法分离出肝非实质细胞,以Sca-1抗体标记的免疫磁珠分选方法加以纯化分离出携带有GFP的SCa-1+细胞。 结果：DDC喂养小鼠6周后,病理切片结果显示肝组织内可见明显的肝卵圆细胞增生反应。分离每只小鼠得可到约106/ml的非肝实质细胞,培养扩增约5d后可见克隆样生长的卵圆细胞,通过Sca-1抗体标记的免疫磁珠分选提纯。电镜下细胞直径10-15μm,呈铺路石样排列,多角形,折光性强,核大,卵圆形,胞浆少,核仁明显。经过鉴定,分离得到的Sca-1+细胞符合卵园细胞的形态学表现,也表达胆管上皮的表面标记OV-6及肝细胞的表面标记AFP,分离纯度达95%以上。 结论：该方法稳定可靠,可为肝卵圆细胞的相关研究提供较为理想的研究手段。 目的：研究肝卵圆细胞在治疗小鼠肝纤维化疾病中的有效性。 方法：SPF级C57BL/6小鼠利用皮下注射四氯化碳的方法,建立小鼠肝纤维化模型。40只肝纤维化模型小鼠分为两大组,将两大组小鼠根据是否继续皮下注射CCl4分为A、B两组,其中A组为施予处理后(HOCA或NSA),继续皮下注射CCl4,B组为施予处理后(HOCB或NSB),不再皮下注射CCl4,每小组10只小鼠。4周后观察肝功能各项指标、羟脯氨酸及胶原纤维及肝脏的病理改变,比较各组间的差别。 结果：卵圆细胞经脾脏移植后入肝,在共聚焦激光显微镜下可以观察到肝组织中存在GFP阳性细胞,这些细胞主要分布于门脉区。在A组继续皮下注射CCl4时,NSA组的ALT.AST均明显升高；而HOCA组ALT.AST明显降低,同时升高TP.ALB；HOCA组与NSA组两两比较,差异有统计学意义(P＜0.05)；在B组未继续皮下注射CCl4时,各组ALT.AST均下降,而且下降至近似正常水平,TP和ALB有升高,但两两比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。肝脏病理学检测,在继续皮下注射CCl4情况下,治疗组肝纤维化程度有减轻,NSA组则呈典型肝纤维化改变；在未继续皮下注射CCl4情况下,两组肝纤维化程度都有不同程度减轻,HOCB组缓解更为明显。 结论：携带GFP的基因卵圆细胞经短暂体外培养扩增,经脾注射肝纤维化小鼠体内后,可定植于受者肝脏内(主要聚集于汇管区),并可缓解肝纤维化的进展,促进肝纤维化的逆转。 目的：比较肝卵圆细胞与骨髓间充质干细胞治疗小鼠肝纤维化的疗效差别。 方法：利用皮下注射四氯化碳的方法,建立小鼠肝纤维化模型。将肝纤维化/肝硬化成模小鼠60只随机分为6组,即HOC移植治疗组A (HOCA)、HOC移植治疗组B (HOCB), MSC移植治疗组A (MSCA)和MSC移植治疗组B (MSCB),对照组A(NSA)和对照组B(NSB),每组10只。根据不同的组别经脾分别输入卵圆细胞、生理盐水(NS)或四氯化碳。4周后观察肝功能各项指标、羟脯氨酸及胶原纤维及肝脏的病理改变,比较各组间的差别。 结果：SPF级C57BL/6小鼠85只,其中6只行骨髓间充质干细胞提取,79只行肝纤维化模型制作,成功造模64只(成功率81%)。分别对两组大鼠肝脏羟脯氨酸及胶原纤维含量这两项指标进行检测,统计分析发现两指标在各组间总体比较均有统计学差别(p＜0.05)。在继续皮下注射CCl4情况下,比较各组间差异显示HOCA组与MSCA组及NSA组之间的差异均有统计学意义(P＜0.05),而MSCA组与NSA组间无统计学意义(p0.05)；在未继续皮下注射CCl4情况下,进一步比较各组间差异显示三组间均无统计学意义(p0.05)。病理组织学检测结果,在未继续皮下注射CCl4情况下,各组肝纤维化程度都有不同程度减轻,肝纤维化程度HOC。组MSCB组NS。组,其中HOCB组肝纤维化程度减轻最为明显；在继续皮下注射CCl4情况下,肝纤维化程度HOCA组MSCA组NSA组,NSA组呈典型肝硬化改变。 结论：肝卵圆细胞和骨髓间充质干细胞经脾注射移植后,均能不同程度改善肝纤维化小鼠的肝功能,减轻其肝硬化的程度,但肝卵圆细胞的治疗效果更为明显。肝卵圆细胞移植可作为肝硬化疾病的一种新型的治疗方法进一步研究。