收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷和5-氮杂-2'-脱氧胞苷对编码和非编码RNA表达的影响

邱湘宁  
【摘要】: 研究背景DNA甲基化是指由DNA甲基转移酶DNMTs催化,在胞嘧啶的第5位碳原子上加上一甲基基团,使之变成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的化学修饰过程,通常发生在双核甘酸CpG中的胞嘧啶,是表观遗传重要的调控机制之一。人类的CpG以两种形式存在,一种是分散于DNA中的CpG位点,另一种是CpG位点富集的CpG岛(CpG Island), CpG岛主要分布在基因中的启动子上。在正常组织里,70%-90%的散在的CpG位点是甲基化的,而CpG岛则是非甲基化的。肿瘤的DNA甲基化改变表现为总体的甲基化水平降低与启动子区CpG岛的甲基化水平升高。抑癌基因与修复基因的甲基化导致抑癌基因沉默与修复基因失活,造成肿瘤抑制丧失与基因损伤增加;而总体低甲基化使反转录转座子、癌基因活化,使染色体不稳定。 5-氮杂胞苷(5-Azacytidine,5-Aza-CR)与5-氮杂脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR)是两种常用的核苷类似物DNA甲基化抑制剂,均已被FDA批准用于骨髓增生异常综合症(myelodysplastic syndrome,MDS)的治疗。5-Aza-CR和5-Aza-CdR在细胞内的代谢有一定差别,5-Aza-CdR的代谢产物以磷酸盐的形式与DNA掺合;而5-Aza-CR大部分代谢产物与RNA结合,少部分代谢产物与DNA掺合。大量的临床试验表明5-Aza-CR和5-Aza-CdR均能缓解MDS病情,但近期的两个临床三期试验结果显示该两种药物在延长MDS患者的生存期上存在差异,5-Aza-CR能够明显延长生存时间,而5-Aza-CdR不能。为了探讨这种差异是否有可能是因为5-Aza-CR除了具有去DNA甲基化作用外,还能与RNA结合而干扰RNA结构和/或功能所致,本研究使用高通量筛选技术来检测这两种药物在使用等毒性剂量处理MDS/AML细胞系(P39细胞系)和实体肿瘤细胞系(T24细胞系)后对信使RNA (Message RNA, mRNA).微小RNA (microRNA, miRNA)和长链非编码RNA (Longer non-coding RNA, ncRNA)表达的影响。 目的:比较等毒性剂量5-Aza-CR和5-Aza-CdR对肿瘤细胞系中多种RNA表达的影响,探讨5-Aza-CR和5-Aza-CdR在细胞内代谢上的差别是否可以影响这两种药物调节编码和非编码RNA表达的能力。 方法:使用等毒性剂量处理血液系统肿瘤细胞系(MDS/AML, P39细胞系)和实体肿瘤细胞系(膀胱移形细胞癌,T24细胞系)。药物处理24小时后(Day1)更换新鲜培养液,于药物处理后48小时(Day 2)及8天(Day 8)两个时间点收集细胞。使用高通量筛选技术(microarray)来检测信使RNA (Message RNA, mRNA)、微小RNA(MicroRNA, miRNA)和长链非编码RNA (Longer non-coding RNA, ncRNA)表达,采用Limma进行差异表达分析。实时定量RT-PCR检测XAGE1D的mRNA表达,甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(MS-SNuPE)检测XAGE1D基因启动子的甲基化状态。 结果:两种药物均能影响mRNA、miRNA和ncRNA的表达。总体而言,5-aza-CdR能比5-aza-CR诱导更多的RNA表达上调,尤其在Day 8时这种差异更明显;Day 2时,5-aza-CR能诱导更多的RNA表达下调。在Day 8时,大部分被5-aza-CR上调的RNA也能被5-aza-CdR诱导表达上调,两种药物共同上调的基因中的一部分属于肿瘤-睾丸抗原基因(CTAs)。在CTAs表达上调的同时,CTAs转录调节因子CTCFL/BORIS表达也上调。另外,在Day 8时,两种药物均能上调白介素和干扰素信号通路中的多个基因的表达,显示该两种药物具有诱导炎症和/或免疫反应的作用。两种药物存在不同的即时效应(Day 2):5-aza-CR能显著下调非编码小RNA的表达;在T24细胞中,5-aza-CR能显著上调tRNA合成酶和参与氨基酸代谢的一些基因的表达。 结论:5-aza-CR和5-aza-CdR这两种药物调节RNA表达的即时效应存在显著性差异,然而其持续效应的主要模式和可能的可遗传的改变是重叠的。 目的:研究miR-886转录本是否是vault RNA2以及DNA甲基化抑制剂5-Aza-CR和5-Aza-CdR能否调节其表达。 方法:通过cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends, RACE)确定miR-886转录本的转录起始位点和3’末端。使用stem-loop RT-PCR检测成熟的miR-886在P39细胞系中各药物处理组中及其他四种细胞系(LD419、UROtsa、T24和UMUC3)中的表达,甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(MS-SNuPE)检测miR-886转录本基因启动子的甲基化状态。采用连续两次转染的方法将Drosha siRNA转染至T24细胞,在第二次转染后72小时收集细胞,采用western blot及实时定量RT-PCR检测Drosha的表达,使用stem-loop RT-PCR检测成熟的miR-886及miR-21的表达。使用RNA聚合酶Ⅱ抑制剂a-amanitin处理T24细胞,分别于24小时、48小时收集细胞,采用RT-PCR来检测miR-886转录本的表达。实时定量RT-PCR及Northern blot检测miR-886转录本(vault RNA2)表达。 结果:miR-886的转录本较一般的pri-miRNA短,其序列与miRbase预测的miRNA前体序列存在差异,可以直接形成茎环结构。无miR-886表达的P39和UMUC3细胞中,miR-886基因启动子处于高甲基化状态,而有miR-886表达的LD419、UROtsa以及T24细胞中,miR-886基因启动子处于低甲基化状态,并且DNA甲基化抑制剂5-Aza-CR和5-Aza-CdR能重新激活miR-886的表达。miR-886的转录本由RNA聚合酶Ⅲ催化转录,而且成熟miR-886的生成不依赖核糖核酸酶ⅢDrosha的加工,证实了miR-886转录本不是miRNA的前体。Northern blot的结果表明miR-886的转录本是vault RNA2,而且vault RNA2能产生miR-886或类似于miRNA的小分子RNA,并且5-Aza-CR和5-Aza-CdR在UMUC3和P39细胞中能重新激活vault RNA 2的表达。 结论:miR-886转录本是vault RNA 2,而且vault RNA 2能产生小分子RNA,即曾被注释为miR-886-3p和miR-886-5p的小分子RNA,并且首次发现DNA甲基化调控vault RNA 2的表达。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前19条
1 孙若熙;;DNA与RNA的作用分析[J];中华少年;2018年25期
2 魏利斌;张海洋;郑永战;郭旺珍;张天真;;芝麻DNA和RNA同步提取方法[J];分子植物育种;2008年05期
3 奚耕思,郎东梅;北京油葫芦卵子发生中DNA及RNA动态变化研究[J];昆虫知识;2003年02期
4 蒋燕,冯玉兰,白小红,陈敏,陈莉;多抗甲素对淋巴细胞合成DNA和RNA影响的实验观察[J];四川医学;2003年01期
5 迟菁华,纪祥瑞,张华,赵杰;葡萄胎DNA和RNA含量与恶变的关系[J];青岛大学医学院学报;2001年01期
6 王晨龙,单礼成,赵珺,尹格平,孙晓明;大肠肿瘤细胞DNA及RNA的定量分析及临床意义[J];外科;1997年01期
7 Christian Larbi AYISI;ZHAO Jinliang;;RNA/DNA Ratio and LPL and MyoD mRNA Expressions in Muscle of Oreochromis niloticus Fed with Elevated Levels of Palm Oil[J];Journal of Ocean University of China;2016年01期
8 ;The effect of retinoic acid on Ito cell proliferation and content of DNA and RNA[J];World Journal of Gastroenterology;1999年05期
9 朱新霞;艾尼江;闫洁;赵海;;同步提取棉花DNA和RNA的方法[J];石河子大学学报(自然科学版);2011年03期
10 李力兵,张立生,左连富;氟烷和七氟醚对兔肝细胞DNA及RNA的影响[J];中华麻醉学杂志;1994年02期
11 童秋声,路承彪;绿舒筋对艾氏腹水癌细胞DNA、RNA及蛋白质合成代谢的影响[J];中药药理与临床;1992年02期
12 周爱儒 ,汤健;APPLICATIONS OF ANTISENSE RNA AND DNA IN CARDIOVASCULAR RESEARCH[J];Chinese Medical Journal;1995年02期
13 杨帆;夏云空;刘晓薇;席德慧;;硫酸庆大霉素中RNA和DNA的检查[J];生物技术世界;2016年02期
14 许凯霞;王永辉;杨向竹;冯前进;;补肾方剂对胎鼠DNA、RNA影响的实验研究[J];新中医;2013年02期
15 蒋昌华;徐健遥;石金磊;张浩;明凤;;月季基因组DNA与总RNA提取方法的优化研究[J];安徽农业科学;2008年21期
16 熊杰,李新民,窦志英,杨常泉,马融,李积胜;高剂量抗痫胶囊对致痫小鼠齿状回DNA和RNA的影响[J];天津中医;2001年02期
17 Hui Wang;Honghong Wang;Chenghui Liu;Xinrui Duan;Zhengping Li;;Enzyme-free and multiplexed micro RNA detection using micro RNA-initiated DNA molecular motor[J];Science China(Chemistry);2016年01期
18 ABDUR Rob;GAN JianHua;HUANG Zhen;;RNA interference with DNA polymerase and synthesis[J];Science China(Chemistry);2014年07期
19 刘定干;同时抽提DNA和RNA的简便方法[J];生命的化学;1998年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 胡成进;杨道理;孙晓明;舒小双;;原发性肝细胞癌RNA、DNA含量测定及临床意义[A];山东免疫学会、山东微生物学会医学微生物学专业委员会、山东省医学会微生物学和免疫学专业委员会、山东省医药生物技术学会2001年学术年会论文汇编[C];2001年
2 郭璕阳;郭奕斌;;利用孕妇血浆和尿样中胎儿游离DNA、RNA进行无创性产前基因诊断[A];遗传学进步与人口健康高峰论坛论文集[C];2007年
3 Haimei Chen;Jianhui Zhang;George Yuan;Chang Liu;;Complex Interplay Among DNA Modification,Noncoding RNA Expression and Protein-coding RNA Expression in Salvia miltiorrhiza Chloroplast Genome[A];第十四届全国中药和天然药物学术研讨会论文摘要[C];2014年
4 武越;朱宏翔;黄云;王静;胡建安;;应用RNA干扰技术研究人支气管上皮细胞中5-脂氧合酶介导4-氨基联苯氧化活化与DNA损伤[A];中国毒理学会第六届全国毒理学大会论文摘要[C];2013年
5 王瑞国;沈远;付汉江;杜彩素;郑晓飞;;DNA损伤反应相关长链非编码RNA筛选及功能研究[A];中国生物化学与分子生物学会第十一次会员代表大会暨2014年全国学术会议论文集——专题报告五[C];2014年
6 熊军;袁必锋;冯钰锜;;大鼠衰老过程中DNA与RNA修饰研究[A];第三届全国质谱分析学术报告会摘要集-分会场5:有机/生物质谱新方法[C];2017年
7 熊军;袁必锋;冯钰锜;;化学衍生-质谱分析用于DNA和RNA中羟甲基和醛基胞嘧啶修饰的高灵敏分析[A];中国化学会第30届学术年会摘要集-第二十八分会:化学生物学[C];2016年
8 熊军;袁必锋;冯钰锜;;大鼠衰老过程中DNA与RNA修饰研究[A];第十届全国化学生物学学术会议论文摘要集(墙报)[C];2017年
9 ;A protocol for extraction of high-quality RNA and DNA from peanut plant tissues[A];遗传学进步促进粮食安全与人口健康高峰论坛论文集[C];2012年
10 龙香娥;龚朝辉;;DNA载体在肿瘤细胞中介导RNA干扰研究[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2008年学术交流会论文摘要汇编[C];2008年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 邱湘宁;DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷和5-氮杂-2'-脱氧胞苷对编码和非编码RNA表达的影响[D];中南大学;2010年
2 凌超;脑垂体瘤基因组DNA甲基化、RNA表达和外显子组研究[D];天津医科大学;2014年
3 郑虹宁;基于DNA环状小分子的DNA和RNA纳米组装技术[D];南京大学;2014年
4 许瑞;RNA介导的启动子DNA甲基化在调控拟南芥盐胁迫应答中的作用研究[D];山东农业大学;2013年
5 殷倩倩;HIV-1血浆RNA与前病毒DNA准种变异的比较和吡啶酮化合物抗HIV-1活性的研究[D];中国疾病预防控制中心;2016年
6 曹智;新型表示模式下的DNA序列和RNA二级结构分析方法研究[D];湖南大学;2010年
7 王英;DNA甲基化在神经病理性疼痛发病机制中的作用[D];中南大学;2012年
8 陈建;玉米核小体定位与基因转录及DNA甲基化的关系[D];中国农业大学;2016年
9 唐阳;基于质谱技术的基因组DNA甲基化及其氧化衍生物分析[D];武汉大学;2014年
10 肖石燕;DNA刚柔性以及禽流感病毒聚合酶PA部分N端与RNA的相互作用[D];中国科学技术大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 康金慧;DNA序列的比较及RNA二级结构计数[D];大连理工大学;2006年
2 谢成;嗜酸菌DNA与RNA同时提取方法的研究[D];中南大学;2012年
3 张美荣;甲醛和苯致DNA、RNA损伤的基因毒性研究[D];苏州大学;2004年
4 张志鹏;基于工具酶信号放大技术化学发光成像分析法检测DNA单碱基错配及多组分小RNA[D];青岛科技大学;2014年
5 刘营;指导RNA偶联转录调控因子抑制基因表达及双链断裂引起DNA重组的研究[D];聊城大学;2017年
6 杨广;钌多吡啶配合物与DNA/三螺旋RNA的作用机制研究[D];湘潭大学;2013年
7 丁天荣;基于核酸内切酶及RNA连接酶的循环放大检测DNA及肿瘤细胞[D];青岛科技大学;2012年
8 王明印;基于DNA分子机器和RNA自发转录的RNA传感器[D];青岛科技大学;2013年
9 崔琮;结直肠癌患者血清外泌体DNA与RNA中基因突变的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2017年
10 骆丽裴;用于鸟嘌呤及其衍生物和微小RNA检测的DNA生物传感器研制[D];福建医科大学;2017年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 黄辛;DNA骨架硫修饰研究又获新成果[N];科学时报;2011年
2 中科院上海生科院上海植物生理生态所 毛颖波;寻找小RNA世界里的另一道风景[N];科学时报;2011年
3 本报记者 辛明;邓亚军:灾难现场的DNA斗士[N];中国青年报;2011年
4 本报记者 欧阳晓红 韩宋辉;“可怕”的友邦DNA 267亿港元净利从何而来[N];经济观察报;2015年
5 记者 颜维琦;我科学家深度“解码”环形RNA[N];光明日报;2019年
6 记者 刘霞;美日创建迄今最大DNA基因模型[N];科技日报;2019年
7 本报记者 沈则瑾;破解环形RNA之谜[N];经济日报;2019年
8 任芳言;古DNA揭示马的身世[N];中国科学报;2019年
9 深圳特区报首席记者 孙锦;解读DNA惠及世界患癌儿童[N];深圳特区报;2018年
10 记者 冯卫东;DNA分子计算为可编程药丸铺路[N];科技日报;2018年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978