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过表达Ack1通过Crk信号通路促进肝细胞癌侵袭转移

李云峰  
【摘要】: 肝细胞癌(HCC)是全球最为常见的恶性肿瘤之一,2002年全球HCC新发病例数为62.6万,而年死亡人数达59.8万,死亡人数与发病人数比接近1:1,预后相当恶劣。中国每年HCC死亡病例数占全球总数的55%,HCC死亡率已达20.37/10万,居国内恶性肿瘤死亡率第二位。综合分析究其原因,其中HCC的高侵袭转移能力是导致其不良预后的关键原因之一。深入探讨HCC侵袭转移的分子机制,阐明在侵袭转移中起关键作用的基因,有助于发现新的HCC预后标志物和研制新的有效的抗HCC药物。我们在先前的临床实践中发现孤立性大肝癌(SLHCC)较结节性肝癌(NHCC)有着明显较低的侵袭转移潜能和较好的预后。在这个非常有意义的临床发现的基础上,我们以SLHCC为切入点对HCC侵袭转移潜能的内在分子机制进行了一系列研究。我们采用了基因芯片的技术分析了在SLHCC和NHCC存在显著差异表达的基因,发现Ackl (Activated Cdc42-associated tyrosine kinase 1)在NHCC中的表达水平较SLHCC显著升高,提示其可能为一个与HCC侵袭转移相关的基因。 Ack1基因定位于人染色体3q29,其编码蛋白大小约120KD,主要定位于细胞胞浆,其分子结构包括一个激酶区、一个SH3区、一个Cdc42/Rac结合区和一个富含脯氨酸的羧基端。Ack1蛋白属于酪氨酸激酶家族,最早作为Cdc42下游的作用蛋白被发现。已有的研究表明,Ack1作为Cdc42下游的效应器参与了多条信号通路,在细胞增殖、运动和侵袭中发挥重要作用。尽管如此,Ack1在恶性肿瘤中作用还远未阐明,其与肿瘤患者的预后关系及肿瘤的临床病理特征的关系尚不清楚,且其在HCC中的作用尚未有研究涉及。基于此,我们在本研究中通过体内和体外两个水平,运用质粒转染、小RNA干扰和裸鼠成瘤等实验方法,对Ack1在HCC侵袭转移中的作用,以及其可能的分子机制进行了一系列研究,主要结果如下: 1.我们运用real-time RT-PCR及Western blot方法在检测了38例手术切除的新鲜HCC和相应的邻近非瘤肝组织(ANLT)以及5例正常肝组织(NL)中Ack1 mRNA和蛋白的表达水平。结果显示Ack1 mRNA和蛋白均在HCC中明显高表达(P0.05)。免疫组化法检测了131例HCC石蜡切片中Ack1蛋白的表达强度。结果显示Ack1在85.5%(112/131)的HCC中表达,根据免疫组化的结果将此131例HCC分为Ack1高表达组和Ack1低表达组并比较两组患者的预后,结果显示Ack1高表达组患者的术后无瘤生存率(P0.05)和总生存率(P0.01)皆明显短于Ack1低表达组。进一步将Ack1蛋白表达水平纳入单因素和多因素Cox比例风险回归模型分析。结果显示Ack1的高表达是HCC患者预后的独立危险因素(RR,1.758;P=0.029)。继而我们又进一步分析了Ack1表达水平与HCC不同临床病理特征之间的关系,结果显示Ack1的表达水平与肿瘤结节数目、细胞分化程度以及有无静脉浸润等与HCC侵袭性生长相关的临床病理特征密切相关(P0.05),并且在NHCC中Ack1的表达明显高于SLHCC。提示Ack1的高表达与HCC的侵袭转移密切相关,并可能因此而导致了HCC患者的不良预后。 2. RT-PCR及Western blot方法检测Ackl mRNA和蛋白在HepG2、MHCC97-L和HCCLM3这3种侵袭转移潜能依次递增的HCC细胞系中的表达水平,并以常氏肝细胞系CCL13作为对照。结果显示Ack1 mRNA和蛋白在3种HCC细胞系中的表达皆显著高于CCL13 (P0.01),且其表达水平在HepG2、MHCC97-L和HCCLM3细胞中依次升高(任意两者比较,P0.05),提示Ack1的高表达与HCC细胞的侵袭转移潜能密切相关。 3.为了寻找Ack1参与HCC的生长和侵袭转移的直接证据,我们接下来采用体内实验进行了验证。我们选取了侵袭转移潜能相对较低的MHCC97-L细胞,利用质粒转染的方法获得了过表达Ack1的MHCC97-L细胞系MHCC97-LAck1,以转染空载体的MHCC97-L细胞系MHCC97-LVector作为对照,并建立了MHCC97-L裸鼠原位HCC生长转移模型,以此观察过表达Ack1对HCC生长和转移的作用。结果显示MHCC97-LAck1组裸鼠所形成的肝脏原位种植瘤的平均体积较MHCC97-LVector组裸鼠明显增大(P0.05),且有着更高肝内转移率(P0.05)和肺转移率(P0.01),提示上调Ack1的表达促进了HCC在体内的生长和转移。 4.为进一步深入研究Ack1在HCC中的作用,解释我们在体内实验观察到的Ack1对HCC生长和转移的作用。我们随后进行了一系列体外细胞学实验,从细胞的层面来观察上调Ack1对HCC细胞恶性生物学行为的作用。生长曲线和平板克隆形成实验的结果显示MHCC97-LAckl细胞较MHCC97-LVector细胞的增殖能力显著增强,生长速度显著加快(P0.05);划痕愈合实验的结果显示MHCC97-LAck1细胞较MHCC97-LVector细胞迁移能力显著增强(P0.01);基质胶侵袭实验显示MHCC97-LAck1细胞较MHCC97-LVector细胞的侵袭能力亦显著增强(P0.01)。进一步行细胞骨架(F-actin)荧光染色发现显示过表达Ack1以后,MHCC97-L细胞的肌动蛋白细胞骨架发生明显形变。这些结果提示上调Ack1能够增强HCC细胞的恶性表型,促进HCC细胞生长增殖、运动和侵袭能力,从而促进HCC的生长和转移。 5.接下来我们进一步研究试图弄清楚Ack1通过何种分子机制促进HCC细胞的恶性生物学行为。鉴于已有的研究证实Crk在肿瘤运动侵袭中发挥着重要作用,并且Crk参与了Ack1的同源蛋白Ack2诱导的细胞运动。因此我们推测Crk亦可能参与了Ack1在HCC中的信号通路。我们首先检测了MHCC97-L细胞中Crk的表达水平,以常肝细胞系CCL13作为对照,结果显示Crk在MHCC97-L细胞中存在明显的表达上调,提示Crk可能在HCC的发生和/或发展发挥了一定的作用。接下来我们用免疫共沉淀的方法证明了在MHCC97-L中Ack1与Crk存在相互作用。随后我们利用小RNA干扰的方法阻断Crk的表达,再重复前面所进行的一系列体内和体外实验,以观察阻断Crk对Ack1诱导的HCC细胞增殖、运动、侵袭和转移的影响。体内和体外的实验显示阻断Crk对Ack1诱导增强的HCC生长和增殖并无显著影响(P0.05);而对Ack1诱导增强的HCC运动、侵袭和转移能力皆有明显抑制作用(P0.05),且进一步研究发现在Crk被阻断的情况下,过表达Ack1不能再对HCC的运动、侵袭和转移产生显著的促进作用(P0.05),提示Crk参与了Ack1诱导的HCC运动、侵袭和转移的信号通路。 通过以上的研究,我们发现了Ack1在HCC中表达上调并且在HCC的侵袭转移中发挥了重要作用。我们还首次证实了Ack1的高表达与肿瘤患者的不良预后以及侵袭转移相关的临床病理特征密切相关;并且首次证实了过表达Ack1通过Crk信号通路实现促进肝细胞癌的侵袭转移。我们的研究提示,Ack1可作为一个新的HCC预后标志物和潜在的侵袭转移干预靶点。


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