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增龄相关听力损失及卡那霉素致聋大鼠耳蜗TMPRSS3、ENaC-α基因表达的初步研究

汪芹  
【摘要】: 研究背景:跨膜丝氨酸蛋白酶3(TMPRSS3)为Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶家族成员,是第一个被发现的致聋的蛋白酶,其基因缺陷是非综合征型常染色体隐性遗传性聋DFNB8/10的遗传学基础,至今已发现该基因14种突变致聋形式,但对于该蛋白酶的功能及其作用机制仍不清楚。 目的:本研究在增龄相关性听力损失和卡那霉素致聋的SD大鼠模型上,通过检测耳蜗中TMPRSS3基因的表达特点,初步探讨其在增龄相关性听力损失及药物中毒性聋中的作用。 方法:用于卡那霉素致聋研究的大鼠均为3月龄,随机分为四组:Ⅰ组(对照组):注射生理盐水14天;Ⅱ组(卡那霉素3日组):肌注硫酸卡那霉素,连续3天;Ⅲ组(卡那霉素7日组):肌注硫酸卡那霉素,连续7天;Ⅳ组(卡那霉素14日组):肌注硫酸卡那霉素,连续14天。用于增龄相关性聋的大鼠按月龄分为三组:3月龄组、12月龄组、24月龄组。通过听性脑干反应(ABR)测试确定各组8 kHz和16kHz的听反应阈。应用免疫组化技术检测各组大鼠耳蜗中TMPRSS3蛋白的表达与分布情况。应用Western blot技术检测耳蜗中TMPRSS3蛋白表达水平。应用荧光定量逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)对大鼠耳蜗中TMPRSS3基因的mRNA表达水平进行检测。 结果:1.卡那霉素致聋大鼠:(1)听功能改变:ABR反应阈由高到低依次为:卡那霉素14日组卡那霉素7日组卡那霉素3日组,而对照组与注射3日组之间ABR反应阈值无明显差异。(2)免疫组化染色:TMPRSS3蛋白在各组SD大鼠耳蜗中均有表达,随注射时间延长,染色阳性程度变弱。(3)Western blot检测:TMPRSS3蛋白在耳蜗的表达浓度随着注射时间延长而减弱。(4)RT-PCR分析:抽提耳蜗组织总RNA电泳结果OD260/280在1.9-2.0之间。TMPRSS3基因的mRNA表达水平随注射时间延长而逐渐下降。 2.增龄相关性听力损失大鼠:(1)听功能改变:在16kHz, ABR反应阈由高到低依次为:24月龄组12月龄组3月龄组,各组间均有显著差异(P0.01)。在8kHz,24月龄组较3月龄及12月龄组大鼠阈值增高,而3月龄和12月龄组之间无显著差异;(2)免疫组化染色:随月龄增长,TMPRSS3蛋白耳蜗染色阳性程度变弱。(3)Western blot检测:大鼠耳蜗中TMPRSS3蛋白.表达浓度随年龄增长而减弱。(4)RT-PCR分析:TMPRSS3 mRNA表达水平随月龄增长而减弱,各组间均有显著差异。 结论:TMPRSS3在SD大鼠耳蜗螺旋器和螺旋神经节细胞均有表达。SD大鼠耳蜗中TMPRSS3蛋白和mRNA表达水平随注射硫酸卡那霉素时间增长和月龄增长而逐渐降低。各实验组TMPRSS3蛋白和mRNA表达水平与听功能保存程度基本一致。上述结果提示TMPRSS3可能在药物中毒和老年性聋的发生中起作用。 研究背景:表皮钠通道蛋白(ENaC)属于ENaC/Deg家族,是由3个同源亚基α、β、γ组成的多聚体,分布于肾小管、结肠、呼吸道上皮细胞表面及耳蜗等处,在耳蜗其主要作用是维持内淋巴的低钠浓度。2002年Guipponi等利用体外爪蟾卵表达系统,证实了TMPRSS3能催化激活ENaC。也有研究发现TMPRSS3致聋的突变体无法激活ENaC。但目前对于ENaC在调节内耳内淋巴代谢、维持内耳正常功能方面的机制尚不清楚。 目的:本研究在对增龄相关性听力损失和卡那霉素致聋的SD大鼠,通过检测耳蜗中ENaC-α基因的表达特点,初步探讨其在老年性聋及药物性听力损失中的作用,及与TMPRSS3的关系。 方法:动物分组处理同第一部分,应用免疫组化技术,检测各组SD大鼠耳蜗中ENaC-α蛋白的表达与分布情况。应用Western blot技术,检测两类致聋模型大鼠耳蜗中ENaC-α的蛋白表达水平。应用荧光定量逆转录多聚酶链反应(RT-PCR),对大鼠耳蜗中ENaC-α基因的mRNA表达水平进行检测。 结果:1.卡那霉素致聋大鼠:(1)免疫组化染色:ENaC-α蛋白在各组SD大鼠耳蜗中均有表达,注射14日组大鼠较注射3日、7日组及对照组的大鼠耳蜗染色明显减弱,但注射3日、7日组及对照组之间无显著差异;(2)Western blot检测:对照组及注射3日、7日的大鼠耳蜗蛋白表达浓度无明显改变,注射14日组较前三组ENaC-α蛋白浓度明显降低。(3)RT-PCR分析:抽提耳蜗组织总RNA电泳结果OD260/280在1.9-2.0之间。注射3日、7日及对照组的大鼠耳蜗mRNA表达水平无明显改变,注射14日组ENaC-αmRNA表达水平较前三组减弱,有统计学显著差异。 2.增龄相关听力损失大鼠:(1)免疫组化染色:SD大鼠随月龄增长,耳蜗ENaC-α蛋白染色阳性程度减弱。(2)Western blot检测:ENaC-α蛋白表达浓度随大鼠月龄增长而降低。(3)RT-PCR分析:大鼠耳蜗ENaC-αmRNA表达水平随月龄增长逐渐减弱,有显著差异。 结论:ENaC-α在SD大鼠耳蜗Corti's器和螺旋神经节细胞均有表达。卡那霉素致聋大鼠耳蜗中ENaC-α蛋白和mRNA表达水平在给药后期明显降低;增龄相关听力损失大鼠随月龄增大而降低。ENaC-α的变化与TMPRSS3有相关性,提示TMPRSS3可能通过调节ENaC-α而起作用。


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