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IgA肾病患者外周血单个核细胞活化与凋亡及雷公藤甲素干预研究

梁倩  
【摘要】: IgA肾病(IgA nephropathy, IgAN)是一类以反复发作性肉眼血尿或镜下血尿,肾小球系膜区IgA沉积为特征的原发性肾小球疾病。免疫细胞、细胞因子是IgAN发病机制的中心环节。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-a, TNF-a)、白介素-6(Interleukin-6, IL-6)和一氧化氮(nitric oxide, NO)是免疫应答及炎症反应细胞因子网络中的重要成分,被认为是各种肾小球肾炎疾病中导致或加重肾脏损伤的重要物质。大量实验证明淋巴细胞凋亡与自身免疫性疾病发病相关,研究表明转染人Bcl-2导致B细胞凋亡缺陷的(NZW×B6)F1-hbcl-2 Tg小鼠可发展为高IgA免疫球蛋白血症和IgAN。因此IgAN PBMC中炎症介质及凋亡情况在发病机制中所起的作用值得进一步研究。 雷公藤多甙(Tripterygium Wilfordii Hook f)因其独特的抗炎及免疫抑制效应已广泛应用于治疗以系膜增生为主的IgAN,其疗效已被大量的临床及实验研究证实。它不仅可以使肾脏病变减轻,而且可使血尿减轻以至消失,但其治疗IgAN的具体机制国内外尚缺乏相关研究,其对IgAN患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)的作用尚未见报道。雷公藤甲素(triptolide,TP)是从雷公藤中分离得到的二萜内酯化合物,是雷公藤的主要有效成分之一。本实验研究IgAN患者PBMC中TNF-α、IL-6、NO表达与凋亡情况,以及TP对上述指标的影响。 目的:研究IgAN患者PBMC中TNF-α、IL-6、NO表达情况,探讨其与发病机制的关系及免疫紊乱程度与临床资料之间的关系。 方法:临床和病理确诊的IgAN患者29例,以及健康体检者16名,分离IgAN患者和正常对照组PBMC,应用RT-PCR检测PBMC中TNF-α、IL-6 mRNA的表达水平,同时分离血浆,采用酶联免疫吸附(ELISA)方法测定其中TNF-α、IL-6的浓度,用硝酸还原酶法(Griess法)检测其NO的含量。 结果: 1.IgAN患者PBMC中TNF-α、IL-6 mRNA表达较正常人显著增加(P0.05;P0.01); 2.IgAN患者血浆TNF-α、IL-6、NO浓度明显高于正常对照组(P<0.01),且三者含量均呈正相关。 3.IgAN Lee氏分级Ⅲ、Ⅳ级患者血浆TNF-α、IL-6、NO含量高于Lee氏Ⅰ、Ⅱ级,肾功能受损(Ccr60ml/mim)患者血浆TNF-α、IL-6含量高于非肾功能受损患者(Ccr60ml/mim),NO含量低于非肾功能受损患者。 4.相关性分析发现,24h尿蛋白排泄量与血浆TNF-α浓度正相关(r=0.27,P0.05),肾脏病理损害程度与血浆TNF-α、IL-6、NO浓度正相关(r=0.56,P0.01;r=0.38,P0.05;r=0.31,P0.05),血尿、血IgA和C3水平与血浆TNF-α、IL-6、NO浓度均无相关性。 结论:IgAN患者体内存在促炎性介质TNF-α、IL-6、NO生成增高,并在其疾病进展中起到重要作用。 目的:探讨PBMC凋亡及其调控蛋白在IgAN发病机制中作用。 方法:应用AnnexinⅤ-FITC凋亡检测试剂盒及流式细胞仪检测IgAN患者及正常人PBMC凋亡率,并采用Westen Blot方法检测IgAN患者及正常人PBMC中凋亡调控蛋白Bcl-2、Bax表达情况。 结果: 1.IgAN患者PBMC早期凋亡率较正常对照组增多(P0.01),24小时尿蛋白量1gIgAN患者组PBMC早期凋亡率高于24小时尿蛋白量1 g组,IgAN患者PBMC早期凋亡率与其血浆TNF-α、IL-6含量明显相关(TNF-α/凋亡率:t=2.79,P0.05;IL-6/凋亡率:t=2.77,P0.05),与血尿、血IgA、血C3水平以及肾脏病理损害程度无相关性; 2.IgAN患者组Bcl-2蛋白的平均相对表达水平高于正常对照组,但无统计学差异(P=0.09); 3.IgAN患者与正常人对照组PBMC中Bax蛋白平均相对表达水平之间差异无统计学意义(P0.05)。 结论:IgAN患者PBMC早期凋亡率增高可能继发于体内免疫紊乱,并参与IgAN发病。凋亡抑制蛋白Bcl-2高表达可能导致自身反应性T、B淋巴细胞寿命延长,产生过多的IgA抗体,从而导致肾小球系膜区IgA沉积增多和IgAN的发生。 目的:观察雷公藤甲素(triptolide, TP)对体外培养IgAN患者PBMC免疫抑制及凋亡诱导作用。 方法:体外分离、培养IgAN患者PBMC,采用四唑盐比色(MTT)间接法观察TP在不同时间段和不同剂量下杀伤活性的变化。培养PBMC,分为阴性对照组、PHA(10μg/ml)模型组和PHA(10μg/ml) +TP(12.5ng/ml、25 ng/ml)处理组,采用定量Realtime-PCR检测TNF-α、IL-6在基因水平表达的变化,用硝酸还原酶法(Griess法)检测细胞培养上清NO的含量变化,酶联免疫吸附方法(ELISA)检测上清液中TNF-α、IL-6的分泌情况。应用流式细胞仪,AnnexinⅤ-FITC双染色分析TP诱导细胞凋亡,RT-PCR、Western Blot方法检测PBMC中Bcl-2、Bax、Caspase 9、Caspase 3基因和蛋白水平的表达变化。 结果: 1.MTT结果显示,在0、5、10、20、40、80ng/ml及24h、48h、72h之内TP对IgAN患者PBMC具有生长抑制作用,呈浓度和时间依赖性; 2.12.5ng/ml和25 ng/ml浓度TP对PBMC作用24h后能明显抑制TNF-α、IL-6 mRNA表达(P0.01),且基因表达水平与TP浓度之间存在负相关(TNF-a:r=-0.98, P0.01; IL-6:r=-0.93, P0.01),TP作用24h后,IgAN患者PBMC培养上清液中TNF-a. IL-6、NO含量明显减低(P0.01),蛋白分泌量与TP浓度之间存在负相关(TNF-a:r=-0.95,P0.01;IL-6:r=-0.98,P0.01;NO:r=-0.91,P0.01); 3.PHA+TP (12.5 ng/ml、25ng/ml)处理组细胞凋亡率较PHA模型组明显增加,有统计学差异(P0.05),细胞凋亡率与药物作用浓度正相关(r=0.89,P0.01);RT-PCR、Western Blot方法检测表明,随处理组所加TP浓度增大,PBMC内细胞内源性Bcl-2表达逐渐降低(P0.05),Bax、caspase 3、caspase 9表达逐渐增加(P0.05),并且Western Blot观察到Caspase 9、Caspase 3激活带随TP浓度的增加明显上调。 结论:TP能有效抑制IgAN患者PBMC TNF-a、IL-6. NO的表达和分泌;TP可以诱导IgAN患者PBMC凋亡,此作用可能通过线粒体途径以及改变Bcl-2家族抗凋亡因子和促凋亡因子的基因和蛋白表达有关。 1.证实IgAN患者体内存在炎性介质TNF-α、IL-6、NO生成增高,体内淋巴细胞处于高活性状态,并在其疾病进展中起到重要作用。 2.证实IgAN患者PBMC早期凋亡率增高,结合前期研究可能继发于体内免疫紊乱,并参与IgAN发病过程。凋亡抑制基因蛋白Bcl-2高表达,可能导致自身反应性T、B淋巴细胞寿命延长,产生过多的IgA抗体,从而导致肾小球系膜区IgA沉积增多和IgAN的发生。 3.证实TP能有效抑制IgAN患者PBMC TNF-α、IL-6、NO的生成和分泌;TP可诱导IgAN患者PBMC凋亡,此作用可能通过线粒体途径以及改变Bcl-2家族抗凋亡因子和促凋亡因子的基因和蛋白表关。 上述研究结果为IgAN发病机制的解释以及TP治疗干预提供了实验依据和理论基础。


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