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光合细菌降解拟除虫菊酯类农药残留物研究

张松柏  
【摘要】: 拟除虫菊酯类农药是具有高效生物活性的一大类杀虫剂,具有杀虫谱广、对温血动物毒性低等特点,在我国被广泛用于粮食、蔬菜和果树等多种作物防治多种害虫。长期大量使用后,该类农药已成为我国农产品中主要的农药残留类型之一。 利用水溶性碳二亚胺(EDC)法将甲氰菊酯的合成前体甲氰菊酸(Fenpropathric acid, FA)与牛血清白蛋白(BSA)偶联,合成了甲氰菊酯的免疫半抗原,免疫新西兰大白兔(New Zealand white rabbit)获得了甲氰菊酯多克隆抗体(Polyclonal antibody, PAb)。通过紫外扫描分析,免疫原中甲氰菊酸分子与蛋白质分子的偶联比为8.8:1,50%饱和硫酸铵法纯化抗体,IC-ELISA(indirect compete enzyme-linked immunosorbent assay)法测定多克隆抗体效价达1:12 800,最适甲氰菊酸-OVA包被抗原质量浓度为1.0μg·mL-1;最低检出限为8.5μg·L-1。以抗体与甲氰菊酯的反应率为100%,抗体与其他4种拟除虫菊酯类农药交叉反应率很低,与溴氰菊酯交叉反应较高。结果表明:制备的甲氰菊酯多克隆抗体具有较高的特异性,建立的IC-ELISA法可用于甲氰菊酯残留物的检测以及拟除虫菊酯类农药残留物降解菌的快速筛选。 采用富集培养,从农药厂废水中筛选能够降解多种拟除虫菊酯类农药残留物的稳定复合菌群,测定其降解拟除虫菊酯类农药残留物的特性,采用16S rDNA-RFLP分析该复合菌群的细菌结构,结果表明:筛选获得了降解多种拟除虫菊酯类农药残留物的稳定厌氧复合菌群,命名为JZ-1,降解特性结果表明:最佳降解条件为pH7、30℃;在最佳条件下培养15d,对100 mg·L-1甲氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯的降解率为53.27%、33.36%、41.39%。菌群JZ-1的16S rDNA扩增和RFLP及测序分析结果表明,复合菌群JZ-1的16S rDNA的克隆文库的库容C为93.54%,文库的覆盖程度较高;Shannon-Wiener多样性指数H为1.20,菌群JZ-1含有丰富的细菌资源;其中的优势种群包括红假单胞菌属(Rhodopseudomonas),紫单孢菌科细菌(Porphyromonadaceae bacterium)。 在筛选的能够降解多种拟除虫菊酯类农药残留物的厌氧复合菌群JZ-1的基础上,通过IC-ELISA法快速筛选降解效率较高的降解菌,然后划线分离、单胞培养分离拟除虫菊酯类农药残留物高效降解菌,生理生化特征结合16S rDNA序列同源性和系统发育分析鉴定降解菌,气相色谱法测定降解菌的降解效率。结果表明,从厌氧复合菌群JZ-1分离到四株光合细菌菌株(命名为:PSB07-6、PSB07-15、PSB07-19、PSb07-21),4个菌株初步鉴定为红假单胞菌(Rhodopseudomonas)。35℃、3000 Lx光照培养15d,4个菌株PSB07-6、PSB07-15、PSB07-19、PSB07-21降解600 mg·L-1甲氰菊酯的速率分别为:1.02 mg·d-1、1.48 mg·d-1、1.13 mg·d-1、2.94 mg·d-1。 选择对拟除虫菊酯类农药残留物降解效率较高的菌株PSB07-15进行降解特性试验,结果表明:PSB07-15能耐受较高浓度(600 mg·L-1)的甲氰菊酯,降解甲氰菊酯的最适温度为20-30℃、pH为6.5-7.5、光照强度2000-3000 Lx。PSB07-15在最佳降解条件下,对600 mg·L-1甲氰菊酯的降解速率为1.87 mg·d-1。PSB07-15降解5种拟除虫菊酯类农药残留物的效率不一致,能有效的降解联苯菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和氟氯氰菊酯等4种拟除虫菊酯类农药残留物,对溴氰菊酯的降解效率不高。PSB07-15以共代谢的方式降解甲氰菊酯,其降解酶属胞内酶。 通过测定PSB07-15降解甲氰菊酯过程中的pH值变化及GC-MS测定中间代谢产物,推测PSB07-15降解甲氰菊酯的机理。结果表明:PSB07-15降解甲氰菊酯的过程中,pH变化比较复杂,1-3d,pH下降,5-9d,pH迅速上升,9-15d,pH逐渐下降;GC-MS检出PSB07-15甲氰菊酯残留物的代谢产物间苯氧基苯乙腈,推测PSB07-15降解甲氰菊酯残留物的可能方式是作用于甲氰菊酯的酯键处。 PSB07-15的生物学特性研究表明,培养24h,PSB07-15产生IAA量为1.81±0.09 mg·L-1,ACC脱氨酶活性的比活力为0.35±0.02U·mg-1。100 mg·L-1的甲氰菊酯对PSB07-15产IAA(1.02±0.05 mg·L-1)和ACC脱氨酶(0.12±0.01 U.mg-1)活性有抑制作用。PSB07-15能显著的促进玉米胚根的生长。 为了探索PSB07-15降解甲氰菊酯残留物的应用潜力,在实验室研究了PSB07-15对水培黄瓜体系中的甲氰菊酯污染的生物修复效率。PSB07-15可以有效降解黄瓜营养液和黄瓜中的甲氰菊酯残留物,培养30d,PSB07-15对黄瓜营养液中100 mg·L-1甲氰菊酯残留物降解率达到47.63%,黄瓜中甲氰菊酯残留物降解率达59.73%。PSB07-15可以显著的增加黄瓜的根长累积增加值以及生物量累积增加值;能够促进黄瓜的根活力值以及根H2O2酶活性,但并不显著。 选择菌株PSB07-21对拟除虫菊酯类农药残留物降解酶基因进行了克隆与分析。PSB07-21降解3种拟除虫菊酯类农药残留物的最佳条件分别为3000 Lx、pH7、35℃;在最佳降解条件下培养15d,PSB07-21对600 mg·L-1甲氰菊酯、氯氰菊酯、联苯菊酯降解率分别为66.63%,43.25%,50.18%。PCR方法从PSB07-21中克隆到一个1050 bp的DNA片段,分析表明该片段包含一个ORF,该ORF的预测蛋白与Burkholderia sp.383的2OG-Fe(Ⅱ) oxygenase的同源性为37.0%。添加0.1 mmol·L-1 Fe(Ⅱ),可提高菌株PSB07-21对甲氰菊酯、氯氰菊酯和联苯菊酯的降解效率。 本研究工作为拟除虫菊酯类农药残留物的降解微生物资源的挖掘和利用提供了科学依据,为利用光合细菌进行生物修复,以及克隆降解酶基因、构建高效降解工程菌提供了理论参考。


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