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内皮源性降钙素基因相关肽合成与释放调节机制及其病理生理意义

张毅民  
【摘要】: 研究背景 降钙素基因相关肽(CGRP)是一种强效的舒血管物质,是辣椒素敏感神经的主要递质,广泛分布于神经和心血管系统。在外周神经系统,背根神经节是CGRP合成的主要部位。除神经细胞外,人淋巴细胞、人肺泡Ⅱ型上皮细胞、Langerhans细胞和内皮细胞等也能合成CGRP。有证据显示,局部来源的CGRP具有特殊的生理作用。我们近来的研究表明,内皮源性CGRP涉及热应激诱导的内皮保护功能。研究发现自发性高血压或苯酚诱导高血压大鼠,神经源性CGRP的产生降低,然而,内皮源性的CGRP的变化和机制尚不清楚。 高血压时,大多数情况下交感神经系统的活力是增加的。研究表明,在苯酚诱导高血压大鼠(交感神经兴奋是其主要机制),血浆去甲肾上腺素(NE,一种非选择性α肾上腺素受体激动剂)水平随着血压升高而增加。我们最近发现,激α2肾上腺素受体,能够诱导内皮细胞CGRP合成与释放。我们推测,在苯酚诱导高血压,NE通过激动α2肾上腺素受体可能上调内皮细胞源性CGRP水平,对抗升高的血压。 在本实验中,利用苯酚诱导高血压大鼠模型和培养的内皮细胞,我们探讨了内皮源性CGRP的变化及其信号途径。 方法 实验一:苯酚诱导高血压中内皮源性CGRP的变化 苯酚诱导的高血压模型:雄性SD大鼠,左肾下极注射10%苯酚50μl制备高血压模型,15 d后取主动脉、肠系膜上动脉。4%多聚甲醛固定,30%蔗糖过夜,制成冰冻切片。取冰冻切片原位杂交检测血管内皮细胞CGRP mRNA的表达,原位杂交及其以前的各步处理中,所有液体试剂都经DEPC处理,抑制RNA酶的降解作用。原位杂交化学反应按常规步骤进行,NBTBCIP染色,图像分析。另取冰冻切片免疫组化检测血管内皮细胞CGRP含量,免疫组织化学按常规步骤进行,DAB染色,图像分析。实验分为3组:①对照组;②高血压组;③药物处理组:给予哌唑嗪(3mg/kg/d),每d灌胃1次,连续给药14 d。 实验二:去甲肾上腺素对内皮细胞CGRP表达的影响及机制 培养人脐静脉内皮细胞株HUVEC-12,分别加入不同剂量的NE孵育内皮细胞,并在确定其量效和时效关系的基础上分别加入特异性α肾上腺素受体阻断剂(哌唑嗪,育亨宾)和特异性一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)以确定信号途径。RT-PCR检测内皮细胞中CGRP mRNA水平,硝酸还原酶法测定细胞培养上清中的总NO含量。 结果 (1)苯酚诱导高血压中,大鼠主动脉、肠系膜上动脉血管内皮CGRP mRNA的表达和CGRP的含量增加,其作用可被哌唑嗪部分阻断。 (2)NE能剂量依赖性上调内皮源性α-和β-CGRP mRNA的表达,并在培养细胞6 h达到最高水平,此作用能被预先给予育享宾和L-NAME取消,但不受哌唑嗪影响。 (3)NE能增加培养细胞上清中的NO含量,此作用能被预先给予育享宾和L-NAME阻断,哌唑嗪无此作用。 结论 在苯酚诱导的大鼠高血压中,内皮源性CGRP合成与释放增加可能是一种内源性对抗血压升高的代偿机制。内皮细胞CGRP的表达受NE的调节,其机制涉及α2受体及NO通路。 研究背景 新近研究发现,除神经细胞外,非神经组织细胞如淋巴细胞、内皮细胞也能合成CGRP。局部来源的CGRP具有特殊的生理作用。例如淋巴细胞能合成和分泌CGRP,参与调节淋巴细胞对于免疫刺激的应答功能。我们实验室工作表明,原代内皮细胞和人脐静内皮细胞株能合成和分泌CGRP,内皮源性CGRP涉及热应激诱导的内皮保护功能。 可乐定是传统的中枢抗高血压药物,为α2肾上腺素受体激动剂,对中枢神经系统有明显的抑制作用。除降低中枢交感神经张力外,可乐定的抗高血压机制尚不完全清楚。研究表明,可乐定能激动内皮细胞上的α2肾上腺素受体而产生血管舒张作用,此作用可被一氧化氮合酶抑制剂L-NAME所阻断,提示NO通路参与了此过程。 本实验探讨可乐定是否能够通过激动内皮细胞上的α2肾上腺素受体调节CGRP的合成与释放,并确定是否涉及NO途径。 方法 培养人脐静脉内皮细胞株HUVEC-12,分别加入不同剂量的可乐定孵育内皮细胞,在确定其量效和时效关系的基础上分别加入特异性α2肾上腺素受体阻断剂(育亨宾)和特异性一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)以确定信号途径。RT-PCR和Real time-PCR检测内皮细胞中CGRP mRNA水平;放射免疫法检测内皮细胞及培养上清中CGRP的含量;硝酸还原酶法测定细胞培养上清中的总NO含量。 结果 (1)可乐定(10-8,1 0-7和10-6M)孵育内皮细胞24 h可剂量依赖性地升高α-和β-CGRP mRNA的表达水平。 (2)可乐定(10-6M)孵育内皮细胞12 h时CGRP mRNA表达水平开始上升,24 h时达最高峰,48 h时仍维持高水平。 (3)可乐定上调内皮源性CGRP mRNA表达和增加培养细胞及上清中CGRP含量,此作用能被预先给予的育亨宾和L-NAME取消。 结论 可乐定能够通过激动内皮细胞α2肾上腺素受体促进CGRP的合成与释放,此过程涉及NO途径,这可能也是可乐定降压作用的机制之一。 研究背景 肾素-血管紧张素系统(RAS)活性增高是造成血压升高的重要机制之一。研究发现,在肾性和自发性高血压大鼠动物模型长期给予肾素-血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)卡托普利及血管紧张素Ⅰ型受体(AT1)拮抗剂氯沙坦后,降压的同时均伴有CGRP的合成与释放增加,这些研究提示,RAS参与CGRP合成与释放的调节。已知RAS在血管重构和高血压的发生发展中起非常重要作用。RAS对神经源性CGRP表达的调节作用已有文献报道,但其对内皮源性CGRP的表达是否具有调节作用尚未见报道。 血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)作为RAS主要的生物活性物质,是机体重要的调节因子,发挥多种生物功能,在血管内外平衡、内膜的形成及心肌梗死后心肌重塑中有重要的作用,可刺激活性氧的产生,诱导血管内皮细胞发生凋亡,而血管内皮细胞凋亡是动脉粥样硬化、心肌梗死等多种心血管疾病发生的始动环节。有文献报道,CGRP具有抗细胞凋亡作用。AngⅡ诱导的内皮细胞凋亡是否与其抑制内皮源性CGRP的表达有关尚不清楚。 新近发现,辣椒素通过激动内皮细胞上的VR1受体能长时程的上调内皮源性CGRP的表达,VR1受体阻断剂caspazepine可以取消此作用。本研究利用培养的内皮细胞探讨以下几个问题:(1) AngⅡ是否能调节内皮源性CGRP合成与释放;(2) CGRP是否具有抗AngⅡ诱导的内皮细胞凋亡的作用;(3)用辣椒素刺激内皮细胞CGRP的合成与释放是否能对抗AngⅡ诱导的内皮细胞凋亡。 方法 实验一:AngⅡ对内皮细胞CGRP合成与释放的影响 培养人脐静脉内皮细胞株HUVEC-12,分别加入不同剂量的AngⅡ孵育内皮细胞,研究其量效和时效关系,并给予特异性ATl受体阻断剂氯沙坦研究其可能的机制。Real time-PCR检测内皮细胞中CGRP mRNA水平;放射免疫法检测内皮细胞及培养上清中CGRP的含量。 实验二:CGRP抗内皮细胞凋亡作用 在培养的人脐静脉内皮细胞给予AngⅡ诱导细胞凋亡,外源性给予CGRP和辣椒素。Hoechst细胞染色、Annexin V-FITC流式细胞检测细胞凋亡;比色法测定caspase-3活性;RT-PCR检测内皮细胞中CGRP、Bcl-2和Bax mRNA的表达。 结果 (1) AngⅡ孵育内皮细胞可剂量和时间依赖性地降低α-和β-CGRP mRNA的表达水平和CGRP含量,此作用可被预先给予的氯沙坦阻断。 (2) CGRP可剂量依赖性降低AngⅡ诱导的内皮细胞凋亡,减弱AngⅡ增加内皮细胞caspase-3活性,此作用能被预先给予的CGRP受体阻断剂CGRP8-37取消。 (3)辣椒素可剂量依赖性上调内皮源性α-和β-CGRP mRNA的表达水平,此作用能被预先给予的VR1受体阻断剂capsazepine取消。 (4)辣椒素可剂量依赖性降低Angll诱导的内皮细胞凋亡,减弱Angll增加内皮细胞caspase-3活性,此作用能被预先给予的capsazepine和CGRP8-37取消。 (5)辣椒素可以上调抗凋亡分子Bcl-2 mRNA的表达,下调促凋亡分子Bax mRNA的表达,此作用能被预先给予的capsazepine和CGRP8-37取消。 结论 AngⅡ能抑制内皮细胞合成与释放CGRP;用辣椒素促进内皮源性CGRP的表达能对抗AngⅡ诱导的内皮细胞凋亡。


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