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重组腺病毒介导人FEZ1基因对前列腺癌细胞株DU145生长影响的实验研究

陈放  
【摘要】: 研究背景 前列腺癌是西方国家最常见的恶性肿瘤,其发病率居美国和西欧国家男性恶性肿瘤的第一,二位,死亡率位于男性恶性肿瘤患者的首位。我国前列腺癌的发病率目前虽然远低于西方国家,但近年来前列腺癌的检出率和发病率呈明显上升趋势,已位居泌尿系肿瘤的第三位,并且一半以上前列腺癌患者确诊时已经是局部进展型和转移型前列腺癌,失去了手术根治性治疗的机会,只能应用内分泌激素治疗。70%-80%前列腺癌细胞会逐渐转变成对激素治疗耐受或没有反应的状态,即所谓的雄激素非依赖性前腺癌。目前,任何对于雄激素非依赖性前列腺癌的治疗,疗效均有限,寻找新的治疗方法迫在眉睫。 基因治疗是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用,从而达到治疗疾病的目的。自从1990年对一个因为腺苷脱氨酶(ADA)缺乏而造成重症联合性免疫缺陷症(SCID)的4岁小女孩进行临床基因治疗获得成功以来,基因治疗在这20年有了飞速的发展。腺病毒载体是目前基因治疗中最常用的载体。FEZ1基因是Ishii H等(1999)对原发性食管癌进行研究时发现的。FEZ1基因全名为F37/食管癌相关基因编码亮氨酸拉链基因序列,简称FEZ1/LZTS1。在肺癌,胃癌,食管癌,膀胱癌,乳腺癌细胞相关研究中均发现FEZ1基因mRNA和FEZ1蛋白表达缺失或显著下降。目前FEZ1基因被认为是候选的抑癌基因,目前考虑FEZ1基因可能通过调节微管和有丝分裂等机制抑制肿瘤细胞生长。目前应用FEZ1基因进行基因治疗已经在MCF7(乳腺癌细胞株)AT 6.2(鼠前列腺癌细胞株)和LNCaP(雄激素依赖型前列腺癌细胞株)SW780细胞(膀胱癌系)细胞中取得了相应的进展。 本课题试图将FEZ1基因引入雄激素非依赖型前列腺癌细胞DU145的基因治疗。用RT-PCR和Western blot技术检测FEZ1基因在不同的前列腺细胞株的差异,PCR技术扩增FEZ1基因片段,并用CloneEZ技术和LR体外重组技术将FEZ1基因片段克隆至腺病毒载体,酶切和测序方法对重组腺病毒载体pAd-FEZ1的鉴定。用MTT法、Hoechst染色法、流式细胞分析法等方法分析感染重组腺病毒载体pAd-FEZ1的DU145细胞增殖凋亡。 目的:了解不同前列腺细胞株中FEZ1基因表达的差异。方法:利用RT-PCR和Western blot技术检测正常前列腺上皮细胞(RWPE-1),雄激素非依赖型前列腺癌细胞株DU-145,前列腺癌细胞株ALAV中FEZ1基因的mRNA量和FEZ1蛋白量,比较三组细胞FEZ1基因的表达差异结果:在三株细胞中均有FEZ1基因的表达,前列腺正常上皮细胞RWPE-1中的表达最强,而前列腺癌细胞DU145、ALAV中的表达量相对较低。结论:FEZ1基因在前列腺正常上皮组织高表达,而在前列腺肿瘤细胞株中低表达。两种肿瘤细胞株表达无明显差异,为FEZ1基因在前列腺癌细胞生长影响研究提供了实验基础。 目的:扩增人FEZl基因,构建和鉴定重组腺病毒表达载体,稳定表达FEZ1基因的前列腺癌细胞株DU145。方法:(1)采用PCR技术扩增FEZ1基因片段,并用CloneEZ技术和LR体外重组技术将FEZ1基因片段克隆至腺病毒载体,构建好重组腺病毒载体pAd-FEZ1后,酶切和测序方法对重组腺病毒载体pAd-FEZ1的鉴定,扩增重组腺病毒rAd-FEZ1并测定滴度。(2)选用最佳的感染复数(multiplicity ofinfection, MOI)的rAd-FEZ1感染DU145,建立重组腺病毒rAd-FEZ1 DU145组腺病毒空载体DU145组,和空白对照DU145组,用RT-PCR Western Blot技术免疫荧光技术,测量FEZl基因的表达,确认构建重组腺病毒rAd-FEZ1 DU145细胞成功。结果:成功扩增FEZ1基因cDNA序列并构建和鉴定重组腺病毒表达载体rAd-FEZ1,成功获得稳定表达FEZ1基因的前列腺癌细胞株DU145。结论:FEZ1基因重组腺病毒载体的成功构建和鉴定,稳定表达FEZ1基因的前列腺癌细胞株DU145的成功构建为前列腺癌细胞生长影响研究提供了实验基础。 目的:观察重组FEZ1基因腺病毒对前列腺癌细胞株DU145生物学特性的影响。方法:测定细胞生长曲线(MTT),Hoechst染色法观察细胞生长形态,流式细胞分析法分析细胞增殖凋亡。结果:(1)MTT法结果,重组腺病毒rAd-FEZ1感染组DU145细胞生长速度慢于腺病毒空载体对照DU145组和空白对照DU145组(p0.05).。腺病毒对照组和正常DU145细胞对照组生长速度无明显差别(p0.05)(2) Hoechst染色法显示FEZ1基因过表达后,48小时的感染,细胞核会呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染,异样细胞核明显增多,明显出现凋亡。(3) AnnexinⅤ/PI流式细胞分析法重组腺病毒组凋亡率较腺病毒对照组和正常DU145细胞对照组高(p0.05).,腺病毒对照组和正常DU145细胞对照组凋亡率无明显差别(p0.05)。结论:FEZ1基因的高表达诱导雄激素非依赖型前列腺癌DU145细胞凋亡和抑制细胞生长增殖。FEZ1基因显示了基因治疗雄激素非依赖型前列腺癌的巨大潜力。


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