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大鼠癫痫持续状态后海马miRNA表达谱的研究

张忱  
【摘要】: 目的 应用miRNA微阵列芯片技术,对大鼠癫痫持续状态(status epilepticus, SE)后海马区脑组织与正常大鼠脑组织中miRNA的表达谱进行对比研究,筛选差异表达miRNA。并对其中差异较大的miRNA在脑组织和外周血的表达量进行检测,运用生物信息学对差异表达miRNA靶基因进行预测和验证。探讨SE后相关miRNA对中枢神经系统损伤的作用机制。 方法 1.建立模型:采用6-8周龄健康雄性SD大鼠,建立氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠SE模型。于造模成功后24小时取脑组织和外周血与正常雄性SD大鼠进行比较。 2. miRNA微阵列芯片筛选差异表达miRNA:提取大鼠脑组织海马区的miRNA,采用miRNA微阵列芯片技术研究SE后大鼠海马区脑组织与正常大鼠海马区脑组织中miRNA表达谱的差异。 3.荧光定量RT-PCR验证差异表达的miRNA:选取有明显差异表达的miRNA,采用荧光定量RT-PCR对其在脑组织海马区的表达进行验证。并对其在大鼠外周血中的表达进行检测,对比脑组织和外周血中的表达差异。 4.生物信息学分析预测靶基因:利用MiRanda软件、TargetScan软件和PicTar软件预测相关差异表达的miRNA的靶基因。 5. Western Blot检测靶基因:根据预测的结果,采用WesternBlot对相关靶基因在SE后大鼠海马区的表达进行检测。 结果 1.SE大鼠和正常大鼠海马组织差异表达miRNA:运用miRNA微阵列芯片,在SE后大鼠海马区脑组织中检测出上调的miRNA基因37个,下调的28个。其中上调大于5倍的miRNA基因为miR-34a、miR-22、miR-125a、miR-213、miR-30c、miR-26a、miR-375、miR-99a、miR-24、miR-124a、miR-101-1。表达差异最大的是miR-34a(25.86倍),差异最小的是miR-188(1.42倍)。下调大于5倍的基因有miR-21、miR-29a、Let-7e、miR-181、miR-215、miR-128a、miR-181b,其中miR-21下调最明显为27.97倍。 2.荧光定量RT-PCR验证差异表达miRNA:选择上调最明显的3个(miR-34a、miR-22和miR-125a)和下调最明显的2个(miR-21和miR-29a),采用实时荧光定量PCR对SE后大鼠脑组织海马区和外周血中差异miRNA的表达进行检测和对比。miR-34a、miR-125a和miR-22表达上调,miR-21表达下调,与芯片结果一致;miR-29a未见与芯片一致的结果。所有目标miRNA在脑组织和外周血的变化趋势均一致;miR-34a、miR-125a和miR-34a在脑组织中表达量高于外周血,miR-22和miR-21脑组织中的表达量低于外周血。 3.靶基因预测结果:利用生物信息学方法对miR-34a、miR-125a、miR-22和miR-21进行靶基因预测,结果提示miR-34a和miR-125a的上调可能调控Bcl-2,miR-21的下调可能调控Caspase-3的表达;这些靶基因都被认为与神经元凋亡有关。 4. Western-Blot检测预测靶基因的表达:对SE后大鼠海马组织的Bcl-2和Caspase-3的蛋白表达进行检测,结果与预测的一致,Bcl-2的表达下调,Caspase-3的蛋白表达上调;这些都将促进神经元凋亡。 结论 1.建立了癫痫持续状态后大鼠和正常大鼠海马区脑组织的miRNA差异表达谱。 2.发现miR-34a、miR-22、miR-125a、miR-21和miR-29a在大鼠脑组织和外周血中的变化趋势一致,有密切的相关性,为进一步将外周血检测miRNA用于相关研究提供依据。 3.miR-34a和miR-125a的靶基因可能是Bcl-2,miR-21的靶基因可能是Caspase-3,它们参与SE后神经元凋亡的调节。


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