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脂肪基质干细胞移植治疗脊髓横断损伤的实验研究

饶以华  
【摘要】: 脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)常导致脊髓损伤平面以下肢体不可逆的神经功能丧失,给家庭和社会带来沉重负担。目前统计资料显示脊髓损伤发病率约为80/100万,并以每年7/1万的速率在增加。脊髓损伤康复一直是临床治疗难点。破解脊髓损伤奥秘及其寻找有效治疗途径是医学工作者的神圣使命。脊髓损伤导致损伤病变部位神经元及神经传导束路的损害。神经传导束功能障碍,引起损伤平面以下的所有功能失去大脑的支配,导致严重的临床症状,表现为截瘫伴随着生活自理能力的丧失。研究者通过移植胚胎中枢神经组织、雪旺氏细胞、嗅鞘细胞等替代缺失的神经细胞,改善局部微环境来促进神经功能的恢复。由于存在移植物的来源限制、组织移植物引起的免疫排斥反应等问题,限制了其临床应用。随着神经生物学和干细胞技术的发展,通过干细胞移植以增加神经细胞数量、减少胶质瘢痕和空洞形成,为治疗中枢神经系统损伤带来了新的曙光。已有研究报道胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓基质干细胞等移植有助于神经功能恢复,然而,伦理道德及取材等多方面的问题使干细胞移植治疗中枢神经系统损伤进展缓慢。脂肪基质干细胞(adipose derived stem cells, ADSCs)由于其完全不存在上述限制,使其获得了广泛的应用前景。由于脂肪干细胞可以在体外长期培养、大量扩增产生充足的细胞来源,具有多向分化潜能,移植后通过迁移修复损伤神经组织,并能适应局部的微环境而分化为合适的细胞类型,也可长期低温冻存而保持其生物学特性不变,因此脂肪干细胞是组织工程理想的种子细胞。目前国内外对脂肪干细胞治疗脊髓横断损伤模型尚未见报道。干细胞移植治疗脊髓损伤有着巨大的潜力,但是真正应用临床面临诸如问题,如移植干细胞替代受损脊髓细胞的机制,如何创造适合神经修复的微环境,如何促进和诱导干细胞定向分化。同时干细胞移植的安全性仍有争议,如移植的细胞在体内分化方向如及是否分化形成肿瘤。因此脂肪干细胞治疗脊髓横断损伤的作用及相应修复机制还有待深入研究。 研究包括以下三个部分。 第一章大鼠脑匀浆上清对脂肪干细胞诱导分化成神经细胞的研究 目的:分离脂肪干细胞,体外传代培养、鉴定及扩增;应用大鼠脑匀浆上清诱导其分化,为实验研究奠定基础。方法:从SD大鼠腹股沟脂肪组织分离得到脂肪干细胞,用含血清培养基对其培养、扩增、传代并纯化。分别用β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol, BME)和大鼠脑匀浆上清诱导脂肪干细胞分化,观察细胞变化,并利用免疫荧光及免疫组化技术对分化后细胞鉴定,同时对ADSCs进行冻存复苏等实验。结果:从大鼠腹股沟脂肪组织获取大量ADSCs,电镜下细胞呈低分化状态,体外诱导后细胞可表达神经细胞标记物(GFAP,NSE),冻存复苏后ADSCs保持干细胞特性。结论:脂肪干细胞具有自我更新及自我分化潜能;脑匀浆上清可诱导其向神经细胞分化;体外可以长期培养,冻存复苏后仍保持干细胞特性。 第二章脊髓横断损伤后脊髓内源性神经干细胞的实验研究 目的:建立大鼠脊髓横断伤模型,观察大鼠脊髓损伤后脊髓内源性神经干细胞的激活情况,检测其特异性标志物Nestin mRNA的表达,寻找干细胞移植治疗脊髓损伤的合适时间窗。方法:制作大鼠脊髓横断伤模型;术前和术后腹腔注射5-溴脱氧尿核苷(Bromodeoxyuridine, BrdU)标记脊髓内源性神经干细胞;取假手术对照组及脊髓横断伤组大鼠脊髓组织冰冻切片,应用免疫荧光标记技术观察大鼠脊髓组织中脊髓内源性神经干细胞的激活后分布情况;取假手术对照组及大鼠脊髓横断伤组术后不同时间点的大鼠脊髓组织标本,检测Nestin mRNA在脊髓组织中的表达。结果:大鼠脊髓损伤后,损伤部位脊髓组织中证实BrdU阳性细胞存在,免疫荧光双标显示,BrdU阳性细胞为神经元和星形胶质细胞,而假手术对照组相同部位BrdU阳性细胞为阴性。RT—PCR结果显示,脊髓损伤后1d,1w,2w,3w,4w Nestin mRNA的表达水平呈上升趋势,4w后表达水平下降,至6w Nestin mRNA几乎无表达。结论:大鼠脊髓横断伤模型可靠并且重复方便;通过脊髓横断伤大鼠模型能够检测到脊髓内源性神经干细胞的激活后分布、增殖、迁移及分化情况,提示脊髓损伤后脊髓组织中的微环境能够激活神经干细胞,并存在适合干细胞移植的时间窗。 第三章脂肪干细胞移植治疗脊髓横断损伤的研究 目的:研究ADSCs移植对大鼠脊髓横断伤模型运动功能的影响及其可能机制。方法:成年S-D大鼠,随机分为假手术对照组(n=10)、脊髓(胸10)横断损伤对照组(n=20)和脂肪干细胞移植组(n=30)。移植后1d、1w、2w、3w、4w,每组各取3只动物(正常对照组共3只)横断损伤处脊髓组织,用RT-PCI法检测GAP-43 mRNA及BDNF mNRA表达。术后10周,取3只脂肪干细胞移植组大鼠脊髓组织进行免疫荧光染色观察ADSCs移植后的存活、迁移和分化情况。三组实验动物术后均采用BBB评分法定期评估运动功能。所得数据进行统计学处理。结果:ADSCs移植后能在宿主体内存活、迁移并分化为GFAP和CAPase阳性神经细胞。ADSCs移植治疗组脊髓组织内GAP-43mRNA和BDNF mRNA的表达上调,较脊髓横断伤组明显增高(P0.05)且持续时间延长(达3周)。ADSCs移植治疗组大鼠后肢的自主运动功能BBB评分明显好于脊髓横断伤组,但两组动物评分均明显低于假手术对照组(P0.01)。结论:ADSCs移植到损伤脊髓后,能在宿主体内存活、迁移并分化为星形胶质细胞和少突胶质细胞。促进GAP-43 mRNA及BDNF mNRA高表达的和持续时间的延长,从而促进神经轴突的修复,改善运动功能。


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