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IDH1基因在人脑胶质瘤中突变及其功能意义研究

曾飞跃  
【摘要】: 目的:分析IDH1R132基因突变在人脑胶质瘤中的分布特征。方法:90例不同级别的胶质瘤活体标本及其血液标本,苯酚—氯仿抽提法提取DNA,设计相应引物,PCR及直接测序。结果:90例胶质瘤标本中共发现42例IDH1基因突变,IDH1基因突变为R132H。其中在Ⅱ、Ⅲ级胶质瘤中发现突变38例,其突变率高达55%(突变平均年龄为38.6±2.2岁;非突变平均年龄为47.5±2.9岁),两组间年龄比较有显著性差异。而在Ⅰ级胶质瘤中未发现;Ⅳ级胶质瘤中发现突变4例,突变率为21.1%(突变组患者平均年龄41.5±2.3岁,非突变组53.3±3.6岁),两组间年龄比较有显著性差异。而所有患者其相应血液标本中未发现该突变。结论:在国内率先报道了IDH1R132基因在中国人群胶质瘤中的突变频率。并且发现突变组平均年龄较非突变组小。 目的:构建稳定表达IDH1 wild-pCDNA3.1及IDH1 R132H-pCDNA3.1的Hela及U251细胞株。方法:将IDHlwild和R132H型分别转染Hela和U251细胞,然后运用RT-PCR、Western-Blotting进行验证。结果:获得了稳定转染IDH1 wild-pCDNA3.1及IDH1 R132H-pCDNA3.1的Hela及U251细胞株。结论:获得了稳定转染IDH1 wild-pCDNA3.1及IDH1 R132H-pCDNA3.1的Hela及U251细胞株。 目的:在稳定转染IDH1 wild及R132H的Hela及U251细胞株中,观察IDH1R132H对细胞功能的影响。方法:(1)通过MTT法检测比较转染细胞活性并绘制生长曲线,并用流式细胞仪检测转染后细胞周期的变化及细胞凋亡的情况;(2)同时对IDH1酶活力进行检测;(3)免疫组化检测同级别胶质瘤中突变标本和非突变标本中HIF-1α及VEGF的表达情况。结果:(1)转染野生型基因的Hela或U251细胞生长增殖速度与空转组、未转染、突变转染组相比均显著降低,突变型与空转组及未转染组相比均无统计学差异。流式细胞仪检测细胞周期发现:空转、野生和突变转染组Hela细胞处于G1期比例分别为:57.75±4.15%、61.10±3.22%、47.41±2.17%,S期的细胞比例分别为:30.54±2.11%、29.81±2.92%、38.84±1.92%,G2期的细胞比例分别:11.70±3.17%、7.21±2.41%、13.74±3.01%。突变转染组细胞出现G2+S期细胞比例高于空转和野生转染组,野生转染组和空转组比较无统计学差异。U251细胞空转、野生和突变转染细胞G2+S比例分别为34.12±3.56%、36.45±4.73%、43.68±3.16%,突变转染组细胞均出现G2+S期细胞比例高于空转和野生转染组,而野生转染组和空转组比较无统计学差异。(2)转染后,酶的活力测定结果表明:与野生转染组相比,Hela突变转染组酶的活力下降了64.09%,空转组下降了72.44%。U251突变转染组酶的活力较野生转染组下降了39.79%,空转组下降了48.9%。野生转染组与突变转染及空转组相比酶活力增加(P0.05),空转组及突变转染组比较无统计学差异。(3)HIF-1α、VEGF阳性反应物分别定位于细胞核、胞浆,染色为棕黄色,两者在突变胶质瘤中阳性表达率显著高于野生组(P0.05)。结论:在两种转染的细胞株中均发现IDH1R132H组生长增殖活跃、而转染野生型后IDH酶活力明显增强。IDH1基因可能是抑癌基因。同时研究发现在同级别胶质瘤突变组中HIF-1α及VEGF表达高于非突变组。 目的:在转染的U251细胞株中,检测IDH1 R132H突变对化疗药物敏感性。方法:观察不同浓度顺铂对于U251细胞株在不同时间点的细胞抑制率。从而选择合适的药物干预浓度及时间点。在转染之野生和突变U251细胞株分别加入顺铂,流式细胞仪检测细胞凋亡及Western-Blotting观察Caspase-3蛋白的表达情况。 结果:突变转染组较野生转染及空转组细胞凋亡明显增加(P0.05);野生转染组与空转组无明显差异。突变组其表达Caspase-3蛋白(P0.05)高于野生转染组及空转组。野生转染与空转组无明显差异。结论:IDH1基因突变后增强了U251细胞对于化疗药物敏感性。


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