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顺铂逆转鼻咽癌紫杉醇耐药分子机制的初步研究

彭小伟  
【摘要】: 第一章顺铂逆转鼻咽癌紫杉醇耐药细胞系的耐药性 目的:比较顺铂对鼻咽癌细胞CNE-1及其紫杉醇耐药细胞系CNE-1/taxol生长抑制率的差异,观察顺铂对鼻咽癌紫杉醇耐药细胞系CNE-1/taxol耐药性的影响。 方法:以CNE-1和CNE-1/taxol为实验对象,通过集落形成试验检测顺铂对CNE-1和CNE-1/taxol的敏感性;运用流式细胞仪检测顺铂对细胞凋亡的影响;等效剂量分析紫杉醇和顺铂联合作用两种细胞产生的效用。 结果:紫杉醇处理CNE-1和CNE-1/taxol后,其IC50值分别为1.33±0.05nmol/L和11.24±0.51nmol/L,显示CNE-1/taxol的耐药指数为8.43;不同剂量(300nmol/L、600nmol/L、900nmol/L、1200nmol/L和1500nmol/L)的顺铂作用于两种细胞后,通过集落形成实验发现顺铂作用于CNE-1/taxol的IC50值为591.1±23.2 nmol/L,而作用于CNE-1的IC50值为1269.6±52.2 nmol/L,显示出CNE-1/taxol对顺铂的敏感性显著高于CNE-1对顺铂的敏感性(p0.01);低剂量顺铂(IC20)预处理细胞后,紫杉醇对CNE-1/taxol生长抑制的IC50值为5.34±0.29nmol/L,耐药指数下降为4.02,其敏感性显著增加(p0.01),而CNE-1对紫杉醇的敏感性没有因顺铂的预处理发生明显变化(P0.05);当紫杉醇和顺铂联合作用CNE-1/taxol, CI值均小于1,表明两药具有协同作用。不同剂量顺铂(300-1500nmol/L)作用于两种细胞后,运用流式细胞仪检测其凋亡率,发现5个浓度顺铂使耐药细胞(CNE-1/taxol)的凋亡率显著高于亲本细胞(CNE-1)的凋亡率(P0.01)。 结论:紫杉醇耐药细胞系CNE-1/taxol对顺铂的敏感性高于亲本细胞CNE-1对顺铂的敏感性;顺铂能够逆转CNE-1/taxol对紫杉醇的耐药性。 第二章应用基因芯片技术筛选鼻咽癌紫杉醇耐药及耐药逆转相关基因的表达谱 目的:应用基因芯片技术筛选鼻咽癌紫杉醇耐药及耐药逆转相关基因的表达谱,试图发现与鼻咽癌紫杉醇耐药及耐药相关的基因。 方法:使用Affymetrix HG-U133 Plus 2.0基因芯片对紫杉醇和顺铂分别处理前后的CNE-1及CNE-1/taxol细胞进行大规模的基因差异表达的检测,并进行数据分析。 结果:经过多重分析与筛选,297个基因可能与紫杉醇耐药及耐药逆转相关。在耐药细胞系下调、而顺铂使之上调的基因有133个,这些基因涉及到了血管形成、凋亡、细胞生长等方面;在耐药细胞系上调、而顺铂使之下调的基因164个,主要涉及类固醇的合成和代谢,以及细胞的生长和凋亡等方面。其中改变超过5倍以上的基因有TSP1、LAMC2、PSG7、NRG1、KRT14、AKAP12、G0S2、TMEM40、MYEOV、SERPINA3、CFI、MAOA、MYOM2、METTL7A、FOS、NOV、ABP1。通过对已知耐药相关基因的分析,结果显示: 1.具有药物转运作用的ATP结合盒家族中MDR1基因在各样本中都没有出现阳性表达;出现差异表达的家族成员中,有个8基因表达上调,而顺铂处理没有使这8个基因的表达下降。 2.P450家族中CYP1A1在亲本细胞中不表达,在耐药细胞中出现了较强的阳性表达,经紫杉醇处理后,其表达进一步大幅下调,顺铂处理后其表达下调。 3.肿瘤坏死因子家族中在耐药细胞系表达下调的有TNFAIP1、3、6、8和肿瘤坏死因子受体TNFRSF10B、12A、21。其中经顺铂处理后出现逆向表达增强的基因有TNFAIP1、3和TNFRSF12A、21 4. Caspase家族除CASP4在耐药细胞中表达下调,经顺铂处理后,其表达进一步下调,而在紫杉醇作用后,表达出现上调。CASP6在耐药细胞中表达上调,经顺铂处理后,其表达出现了下调,其余的Caspase家族成员的表达变化都不明显或者不表达。 5.与紫杉醇耐药相关的β-微管蛋白同型中除β-微管蛋白Ⅱ出现差异表达外,β-微管蛋白Ⅲ、Ⅵ在各样本中表达差异不明显(p0.05),β-微管蛋白Ⅰ、Ⅳ在6个样本中都没有出现阳性表达 6.紫杉醇耐药基因TXR1在耐药细胞中表达上调,经紫杉醇和顺铂处理后,其表达变化均不明显。凝血酶敏感蛋白TSP1基因在耐药细胞中表达下调,经紫杉醇处理后,表达进一步下调,但是,经顺铂作用后,其表达出现了明显的上调。 结论:17个显著变化的基因可能与鼻咽癌紫杉醇耐药及耐药逆转相关,如TSP1、LAMC2等。目前认为与紫杉醇耐药相关基因中的ATP-结合盒转运体家族、β微管蛋白都不是CNE-1/taxol耐药性产生过程中的关键因素;凋亡相关基因Caspase家族表达与CNE-1/taxol耐药性无关,而肿瘤坏死因子家族的部分基因可能参与了鼻咽癌紫杉醇耐药;CYP1A1的表达改变可能与CNE-1/taxol的耐药及耐药逆转有一定的相关性。 第三章TXR1/TSP1信号通路与鼻咽癌紫杉醇耐药及耐药逆转的关系 目的:探讨TXR1/TSP1信号通路在鼻咽癌紫杉醇耐药及耐药逆转中的作用。 方法:通过RT-PCR、免疫荧光和western blot,在mRNA及蛋白质水平对基因的表达进行验证,同时,运用不同的药物剂量处理CNE-1和CNE-1/taxol,观察TSP1的表达变化。 结果:通过RT-PCR试验,发现TXR1在CNE-1/taxol的表达大约是CNE-1的7倍;而TSP1在mRNA和蛋白质水平分别下调了8.9和5.6倍;经591.1 nmol/L (IC50)顺铂作用24h后,CNE-1/taxol中TSP1在mRNA水平表达上调了8.7倍,经300 nmol/L-1500 nmol/L顺铂作用后,随着药物浓度的增加,TSP1蛋白的表达随之上调;然而,两种细胞经顺铂作用后,TXR1的表达都没有出现明显的改变。 结论:CNE-1/taxol耐药性的产生可能与TXR1的表达有关,并且是通过下调TSP1的表达实现的;顺铂可能是通过上调TXR1的下游基因TSP1来逆转CNE-1/taxol的耐药性的。


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