骨髓内皮祖细胞和间充质干细胞对动脉粥样硬化血管内皮的修复作用

【摘要】： 心血管系统疾病是现代社会严重威胁人类健康,引起死亡的主要疾病。动脉粥样硬化(AS)是心血管疾病的主要病因之一,阻止AS的进展已成为基础医学和临床医学研究的热点。许多心血管疾病发生的危险因素,如老年、吸烟、糖尿病、高血压、高脂血症等都会造成以内皮细胞合成一氧化氮(NO)能力下降,细胞膜结构发生改变为主要特点的血管内皮功能失调,血管内皮功能失调是AS发生的第一步。AS治疗应包括早期阻止内皮功能失调、内皮细胞凋亡、防止AS斑块进展。如何对损伤的内皮进行修复,已成为AS研究的重点内容。 研究表明内皮祖细胞(EPC)具有修复和替代损伤血管内皮细胞的功能。将体外培养的EPC输入血管受损的大鼠体内,能促进内皮再生；生理条件下,轻微受损的血管内皮细胞可以通过邻近细胞的增殖得到修复,而强烈的氧化应激反应导致的内膜损伤则要通过循环中EPC归巢到损伤部位来修复。 研究发现,在成体外周组织,包括某些正常及损伤血管壁附近均存在一类具有骨髓间充质干细胞特征的细胞,这些细胞可能参与了血管组织更新和损伤后的修复过程。离体研究证实骨髓MSC在一定条件下可分化为ECs,分化后的MSC表达ECs特有标志,如血管内皮细胞生长因子受体2(KDR)、血管内皮细胞生长因子受体1(Flk-1)及血管细胞黏附分子(VCAM-1)等；此外间充质干细胞可能分泌多种细胞因子,为受损血管的修复和新血管的生成提供了适当的微环境。 本研究旨在建立高脂饮食导致的动脉粥样硬化模型,研究大鼠骨髓来源的EPC和MSC对动脉粥样硬化的治疗作用,比较两者的治疗效果,寻找AS细胞治疗的有效方法。 第一章骨髓FPC和MSC的分离培养、鉴定 目的 分离培养大鼠骨髓EPC和MSC,研究其生物学特性。 方法 1、无菌条件下取大鼠股骨,冲出骨髓细胞,用大鼠淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,将其重悬在MSC培养液中培养,检测其生物学特性(流式和免疫组化分析表面标志、生长特性)及多向分化潜能(向脂肪细胞、成骨细胞分化)。 2、分离大鼠骨髓单个核细胞,将其重悬在内皮细胞培养液中培养。应用免疫细胞化学检测内皮细胞表面标志(vWF、CD31、CD144),通过UEA-1结合能力、乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)摄取能力的检测鉴定培养的内皮祖细胞,并研究细胞的生长特性和克隆形成能力。 结果 1、骨髓MSC的生物学特性：第三代贴壁细胞均表达MSC表面标志物CD29,CD90,不表达CD34、CD45造血细胞表面标志和CD31、vWF内皮细胞表面标志。第三代MSC接种后第1-2天生长较缓慢,从第3天起细胞开始增殖并进入对数生长期,细胞迅速增殖。根据公式DT=t×1g2／(1gNt-1gN0),得出MSC倍增时间49.13±0.7h。 2、培养的骨髓间充质干细胞在特定的培养条件下具有向脂肪细胞、成骨细胞分化的能力,符合骨髓间充质干细胞判断的金标准。 3、培养的EPC vWF、CD31、CD144表达阳性,具有与UEA-1结合能力和摄取DiI-AC-LDL的能力。EPC的生长特性为：接种后第1-6d为潜伏期,从第6 d起细胞开始增殖并进入对数生长期。不同传代次数之间的EPC其增值能力存在差异,P2代细胞增殖能力强于P5代,它们的增殖能力在第8天显示出差异(p0.05),第10天出现显著差异(p0.01),P2和P5EPC的倍增时间分别为：82.70±4.28h和90.88±5.30h。骨髓EPC具有克隆形成能力,并且克隆形成的数目与再种植细胞数量之间呈良好的线性关系,接种4000、6000、8000、10000个细胞可分别形成22.00±3.60、33.67±5.13、42.00±3.00、61.00±4.58个内皮细胞集落。 结论 从大鼠骨髓单个核细胞成功分离培养获得MSC和EPC。 第二章动脉硬化大鼠动物模型的建立及动脉硬化大鼠血管内皮的衰老分析 目的 建立SD大鼠动脉硬化模型；观察大鼠血管内皮细胞衰老改变。 方法 1、SD大鼠28只,随机分为A、B、C、D 4组,每组7只。A组喂食普通饲料,B、C、D组喂食高脂饲料。大鼠高脂饲料喂养12周后测定血脂的变化,HE染色分析主要动脉血管结构的改变。 2、胶原酶灌注方法,分离胸主动脉和肾动脉血管内皮细胞,应用免疫细胞化学的方法,鉴定内皮细胞；应用细胞化学染色的方法检测衰老相关的半乳糖甘酶(SA-β-gal)活性。 结果 1、SD雄性大鼠高脂饲料喂养12周后,大鼠血液甘油三脂、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇水平明显升高；高脂血症大鼠动脉血管出现明显的粥样硬化改变。 2、分离培养后的胸主动脉和肾动脉血管内皮细胞表达vWF,CD31；高脂饮食后的大鼠血管内皮细胞衰老增加,SA-β-gal活性明显增加。 结论 1、成功建立SD大鼠动脉粥样硬化模型。 2、高脂血症引起大鼠动脉结构发生病理改变,动脉血管内皮细胞衰老增加,SA-β-gal活性增加。 第三章骨髓EPC、MSC对动脉粥样硬化血管的修复作用 目的 研究大鼠骨髓来源的EPC和MSC对动脉粥样硬化治疗的效果。 方法 1、包装、纯化rAAV2-IRES-GFP,并转染EPC和MSC。 2、将转染了rAAV2-IRES-GFP的EPC和MSC经尾静脉分别移植入高脂饮食大鼠体内,病理对照组注射生理盐水。注射后两个月,检测血脂水平；HE染色观察主动脉的组织学改变；冰冻切片荧光显微镜下观察GFP标记的细胞。 3、RT-PCR检测主动脉壁一氧化氮合酶(eNOS)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)及载脂蛋白E (apoE) mRNA的表达。 结果 与病理对照组比较,EPC和MSC细胞治疗后大鼠血脂水平呈明显下降趋势,动脉壁脂质沉积减少；主动脉冰冻切片中可以检测到GFP标记的细胞,细胞排列整齐,衬在血管内膜上；动脉璧ICAM-1的mRNA表达水平明显降低,而apoE及eNOSmRNA的表达水平与正常对照组相比有明显的增高,三种基因的表达以EPC治疗组改变最为显著,提示EPC对动脉粥样硬化的修复作用优于MSC。 结论 EPC和MSC对动脉硬化老化的大鼠血管内皮具有一定的修复作用,两者比较,EPC对动脉粥样硬化的修复作用优于MSC。