收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

转录因子RFX1在系统性红斑狼疮发病中的作用研究

高飞  
【摘要】: 研究背景:系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种病变累及多系统、多器官,严重危害人类健康的自身免疫性疾病。然而SLE确切的病因及发病机理尚不明确。越来越多的研究表明表观遗传机制,特别是DNA低甲基化在调控T细胞自身免疫相关基因表达及SLE发病中起着十分重要的作用。表观遗传修饰主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA调控。DNA甲基化是重要的表观遗传学机制之一,在胚胎发育、基因印迹、X染色体失活、调节基因的表达及DNA与蛋白质之间的相互关系、染色质结构改变等方面发挥重要作用。已有研究表明在体外抑制T细胞DNA甲基化,可使T细胞甲基化敏感基因调控序列特定区域低甲基化,从而导致基因过度表达。这些基因包括CD11a (ITGAL)、perforin (PRF1)、CD70 (TNFSF7)及CD40 ligand(TNFSF5)。研究发现,SLE患者外周血CD4+T细胞中CD11a、CD70等基因表达异常升高。而过度表达这些基因的T细胞具有自身反应性,杀伤自身巨噬细胞或辅助B细胞产生大量的自身抗体,在动物体内能诱导狼疮样疾病。目前研究已证实CD70和CD11a等基因过度表达是导致T淋巴细胞异常活化和系统性红斑狼疮(SLE)发病的重要机制之一,然而上述基因过度表达的分子机制尚未完全阐明。我们通过转录因子活性谱芯片检测发现SLE患者CD4+T细胞中存在多个具有差异活性的转录因子,如RFX1和SRF。进一步研究我们证实转录因子RFX1的表达和活性在SLE患者CD4+T细胞中显著下调。生物信息学预测CD70和CDlla基因转录起始位点上游存在RFX1结合位点,提示RFX1可能参与调控SLECD4+T细胞中CD11a和CD70等自身免疫相关基因的表达。本研究我们通过转基因和RNA干扰的方法揭示转录因子RFX1在SLE发病过程中的作用,该研究将有助于进一步阐明SLE发病的分子机制,并有可能为SLE的治疗提供新的思路和途径。 第一部分筛选、鉴定具有差异活性的转录因子 目的利用转录因子芯片高通量筛选在SLE患者CD4+T细胞和健康对照之间具有差异活性的转录因子。 方法密度梯度离心分离6例SLE患者和6例正常人的外周血单个核细胞,磁珠分选CD4+T细胞,提取核蛋白,采用CapitalBio公司提供的含有225个转录因子探针的微阵列筛选SLE患者和正常人之间具有差异活性的转录因子。提取9例SLE患者和9例正常对照的CD4+T细胞核蛋白,利用转录因子-酶联免疫吸附试验(Transcriptional factors-enzyme linked immunosorbent assay, TFs-ELISA)检测转录因子的活性。收集31名活动期SLE患者和33名健康对照人群的外周血CD4+T细胞,采用Qiagen公司的RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA,实时定量逆转录-聚合酶链反应(Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction, real-time RT-PCR)检测mRNA表达水平;抽提CD4+T细胞总蛋白,Westernblot检测蛋白表达水平。 结果转录因子芯片检测结果显示:与健康对照相比,转录因子RFX1、SRF、MIF1在SLE患者CD4+ T细胞中转录活性分别下降2.55±0.18,2.85±0.28和3.03±0.4倍;而转录因子E4BP4活性升高1.58±0.25倍。进一步的TFs-ELISA实验证实:SLE患者CD4+ T细胞中RFX1和SRF转录活性显著下降,与芯片结果一致。Real-time RT-PCR及Western blot结果显示:与正常对照相比,SLE患者CD4+T细胞中RFX1基因mRNA、蛋白表达水平均显著降低(P0.01),SRF蛋白表达水平均显著降低(P0.05)。 结论SLE患者CD4+T细胞中多个转录因子活性发生改变,其中转录因子RFX1和SRF的活性和表达水平较健康对照均显著性降低,提示这些转录因子可能在SLE发病过程中发挥重要作用。 第二部分:转录因子RFX1在SLE发病中的作用 第一节特异性抑制RFX1可诱导正常CD4+T细胞自身反应性 目的特异性抑制转录因子RFX1表达对正常CD4+T细胞中自身免疫相关基因CD11a和CD70的表达水平及其刺激B细胞产生自身抗体的影响。 方法构建特异性抑制RFX1表达的RNA干扰载体(pSUPER.RFX1),利用Qiagen公司的质粒抽提试剂盒大量抽提质粒,Lonza公司的人T细胞转染试剂盒和Amaxa nucleofector细胞转染仪用于T细胞转染。Western blot检测RFX1蛋白的表达水平,Real-time RT-PCR法检测CD11a和CD70基因mRNA的表达水平,流式细胞仪检测CD11a和CD70基因的蛋白表达水平。T细胞和同源B细胞(1:4)孵育,37℃培养8天,收集细胞培养液,ELISA法检测抗体IgG的浓度。 结果与对照组相比,转染干扰载体pSUPER. RFX1的正常CD4+T细胞RFX1蛋白表达水平显著降低(P0.05),而CD11a和CD70基因mRNA及蛋白(mean fluorescence intensity, MFI)水平则显著升高(P0.01),转染干扰载体pSUPER. RFX1的正常CD4+T细胞与自身B细胞孵育,B细胞产生IgG抗体产量显著增加(P0.05)。 结论下调RFX1表达可导致CD4+T细胞自身免疫相关基因CDlla和CD70表达升高,诱导B细胞产生大量自身抗体。 第二节过表达RFX1可抑制SLE患者CD4+T细胞自身反应性 目的过表达转录因子RFX1对SLE患者CD4+T细胞自身免疫相关基因CD11a和CD70的表达以及其刺激B细胞产生自身抗体的影响。 方法构建RFX1真核表达载体pSG5-RFX1,Lonza公司的人T细胞转染试剂盒和Amaxa nucleofector细胞转染仪用于T细胞转染。Western blot检测RFX1蛋白的表达水平,Real-time RT-PCR法检测CDlla和CD70基因mRNA水平,流式细胞仪检测CDlla和CD70蛋白水平,T、B细胞孵育实验及ELISA法检测自身抗体IgG产量。 结果与对照组相比,转染pSG5-RFX1的SLE患者CD4+T细胞RFX1蛋白表达水平显著升高(P0.05),CD11a和CD70基因mRNA及蛋白(MFI)水平显著降低(P0.01),转染pSG5-RFX1的SLE患者CD4+T细胞与自身B细胞孵育,B细胞产生IgG的产量显著降低(P0.05)。 结论增加CD4+T细胞的RFX1表达水平可抑制SLE患者CD4+T细胞自身反应性和自身抗体的产生。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 ;[J];;年期
2 ;[J];;年期
3 ;[J];;年期
4 ;[J];;年期
5 ;[J];;年期
6 ;[J];;年期
7 ;[J];;年期
8 ;[J];;年期
9 ;[J];;年期
10 ;[J];;年期
11 ;[J];;年期
12 ;[J];;年期
13 ;[J];;年期
14 ;[J];;年期
15 ;[J];;年期
16 ;[J];;年期
17 ;[J];;年期
18 ;[J];;年期
19 ;[J];;年期
20 ;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 卢桂玲;;系统性红斑狼疮患者Th1/Th2相关转录因子的基因表达[A];2010全国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2010年
2 潘海峰;叶冬青;;Th17及其相关细胞因子与系统性红斑狼疮的发病机制研究进展[A];华东地区第十次流行病学学术会议暨华东地区流行病学学术会议20周年庆典论文汇编[C];2010年
3 黄卫华;;免疫吸附治疗重症系统性红斑狼疮[A];第十一届全国中西医结合肾脏病学术会议论文汇编[C];2010年
4 张闽光;张晓嫣;王建萍;邢东炜;苏晓;;系统性红斑狼疮胸部CT短期随访分析(附64例报告)[A];第十一次全国中西医结合影像学术研讨会暨全国中西医结合影像学研究进展学习班资料汇编[C];2010年
5 梁军亮;陈宏;;亲环素A mRNA在系统性红斑狼疮患者外周血中的表达及其临床意义[A];第五届全国中西医结合变态反应学术会议论文集[C];2011年
6 王友莲;付强;桂小美;施春花;张娜;邹伏英;尚可;;系统性红斑狼疮患者血清C1q检测临床意义[A];2011年华东六省一市风湿病学学术年会暨2011年浙江省风湿病学学术年会论文汇编[C];2011年
7 吴凤霞;杨程德;袁国华;;趋化因子CXCL13在系统性红斑狼疮患者的血浆表达及其临床意义[A];2011年华东六省一市风湿病学学术年会暨2011年浙江省风湿病学学术年会论文汇编[C];2011年
8 李文先;陈贵梅;袁慧;李若洁;叶冬青;;TIM家族基因多态性与系统性红斑狼疮的相关性研究[A];华东地区第十次流行病学学术会议暨华东地区流行病学学术会议20周年庆典论文汇编[C];2010年
9 刘钢;;类风湿关节炎及系统性红斑狼疮辅助检查路径分析与临床诊治[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年
10 陈士伟;沈茜;;循环miR-189对系统性红斑狼疮的诊断意义和价值[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张少然;T辅助细胞亚群联合检测对系统性红斑狼疮病情评估价值的研究[D];山西医科大学;2011年
2 陶金辉;滤泡辅助性T细胞与系统性红斑狼疮的相关性研究[D];安徽医科大学;2011年
3 韩建文;中国汉族人系统性红斑狼疮全基因组关联分析研究[D];安徽医科大学;2010年
4 张立民;系统性红斑狼疮MicroRNA表达谱和功能的初步研究[D];中国协和医科大学;2010年
5 邹延峰;安徽省农村人口系统性红斑狼疮患病率及其环境相关因素研究[D];安徽医科大学;2011年
6 周迪;膜联蛋白A5影响系统性红斑狼疮血栓形成倾向的研究[D];第三军医大学;2012年
7 李静;RIP2基因单核苷酸多态性及血清水平与系统性红斑狼疮的相关性研究[D];安徽医科大学;2012年
8 吴倩;IFNλ1在系统性红斑狼疮中的表达及作用机制研究[D];山东大学;2012年
9 李连红;ITGAM和FcγRIIIA与系统性红斑狼疮发病相关性的分子流行病学研究[D];安徽医科大学;2010年
10 张宁;TLR信号通路有关基因与系统性红斑狼疮的相关性研究[D];安徽医科大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 罗雄燕;系统性红斑狼疮中维生素D受体基因多态性的致病作用和血液系统异常的病理机制的研究[D];川北医学院;2011年
2 周卫;女性系统性红斑狼疮外周血单个核细胞中雌激素受体的表达及其在炎性病变中的作用研究[D];川北医学院;2011年
3 张滔;汉族人群干扰素调节因子3基因多态性及环境因素与系统性红斑狼疮的关联性研究[D];安徽医科大学;2010年
4 朱立炜;系统性红斑狼疮患者生活质量与临床护理的相关研究[D];安徽医科大学;2010年
5 王贞;高级氧化蛋白产物在系统性红斑狼疮早发动脉粥样硬化中的临床意义[D];福建医科大学;2010年
6 邓红宇;系统性红斑狼疮患者外周血内皮祖细胞数量及分化功能的研究[D];泸州医学院;2011年
7 朱青青;3种基质金属蛋白酶与系统性红斑狼疮的相关性研究[D];安徽医科大学;2010年
8 吴凤霞;趋化因子及受体基因单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮的相关性研究[D];川北医学院;2010年
9 高飞;转录因子RFX1在系统性红斑狼疮发病中的作用研究[D];中南大学;2010年
10 杜晓敏;血清骨桥蛋白水平与系统性红斑狼疮疾病活动性及脏器损害的相关性研究[D];天津医科大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报记者 朱永基;首个SLE数据库助力规范化诊疗[N];健康报;2011年
2 邵建国;B细胞药物:靶向系统性红斑狼疮[N];医药经济报;2009年
3 俊英;中西医结合可延长系统性红斑狼疮稳定期[N];中国医药报;2009年
4 孙维生;如何早期防治系统性红斑狼疮?[N];潮州日报;2009年
5 陈静;系统性红斑狼疮研究成果获国家科技进步二等奖[N];保健时报;2010年
6 北京大学人民医院风湿免疫科教授 栗占国 本报记者 魏平 整理;解救系统性红斑狼疮:糖皮质激素治疗贯穿始末[N];医药经济报;2011年
7 本报记者 胡德荣;降伏红斑狼疮 “仁济”领跑[N];健康报;2010年
8 上海岳阳中西医结合医院风湿免疫科 薛鸾 主任医师;系统性红斑狼疮的预后和转归[N];上海中医药报;2010年
9 记者 王丹;系统性红斑狼疮“中国数据”发布[N];健康报;2011年
10 通讯员 孙国根 记者 陈青;系统性红斑狼疮有新疗法[N];文汇报;2011年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978