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碱性成纤维生长因子联合全反式维甲酸诱导脐血单个核细胞分化为神经细胞的实验研究

陈喜安  
【摘要】: 目的:1.探讨脐血单个核细胞(CB-MNCs)的体外分离、培养、扩增的规律和特点,初步探讨脐血单个核细胞(CB-MNCs)在体外向神经细胞分化的条件。2.采用全反式维甲酸(All-Trans-Retinoic Acid,RA)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作为诱导剂,对脐血单个核细胞(CB-MNCs)进行体外诱导实验。探讨RA和bFGF体外诱导脐血单个核细胞分化为神经细胞的机制,为脊髓损伤的细胞移植治疗提供实验基础。 方法:1.收集脐血:收集妊娠足月正常分娩的新生儿脐带血,按卫生部颁布的《献血体检标准》检验合格,于第3产程自脐静脉消毒后全封闭采集脐血,CPD21抗凝,平均采量80-130ml。2脐血分离:新鲜脐血在24小时内分离。新鲜血液与PBS按1:l比例混匀并制成细胞悬液,叠加到淋巴细胞分离液上,2000 r/min离心20 min,然后取出白膜层,1000 r/min离心10 min,弃上清,然后调整细胞浓度为1×106/ml。3.分组:将上述CB-MNCs以3×106个细胞接种于6孔培养板,每孔终体积3ml(含20%FBS的H.DMEM。双抗生素青、链霉素各100U/ml);按诱导体系中诱导因素的不同组合分4组,A组:对照组,不加任何因子。B组:加全反式维甲酸。C组:加碱性成纤维生长因子。D组:加碱性成纤维生长因子和全反式维甲酸。每日在倒置显微镜下观察细胞的形态变化,每3天更换培养基,弃未贴壁细胞;2周后观察结果。4.细胞免疫荧光鉴定:采用细胞免疫荧光方法,对以上四组细胞诱导2周后检测神经元标志物Tuj-1和星形胶质细胞标志物GFAP的表达情况,荧光显微镜下观察并拍照记录。荧光显微镜下在各组细胞随机取100个细胞,计数Tuj-1及GFAP反应阳性细胞个数之和,统计学分析:数据均以x±s表示,并用SPSS17.0软件进行单因素方差分析。 结果:1,倒置显微镜下形态观察结果:刚分离的CB-MNCs呈小、圆形,1d后,少量细胞贴壁生长,未见明显形态变化;6d时B、C、D组均可见一些细胞伸出胞突,有的呈梭状,有的伸出细丝状的突起;10d时,D组细胞可见一些细胞胞体变大、胞突伸长,有的细胞双极,有的多极;14d后,A组细胞未见明显变化,而B、C、D组可见一些胞体较大、有数个粗长突起的细胞生长,相邻细胞突起连成网状,类似神经元。2,细胞免疫荧光结果:CB-MNCs诱导为神经细胞,经统计学分析,(1)诱导后D组分化率最高,与其它组有显著差异(P0.05);(2)诱导后B、C、D组与A组分化率有显著差异(P0.05);(3)B和C组分化率无显著差异(P0.05)。 结论:1.全反式维甲酸与碱性成纤维生长因子均能诱导脐血单个核细胞分化成神经细胞。2.碱性成纤维生长因子联合全反式维甲酸能协同诱导脐血单个核细胞分化成神经细胞,提高脐血单个核细胞的神经细胞转化率。


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