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竹节参总皂苷提取、纯化工艺及其抗肿瘤活性的初步研究

欧阳丽娜  
【摘要】:竹节参(Rhizoma Panacis Japonici)为五加科(Araliaceae)植物竹节参(Panax japonicus C.A.Mey.)的干燥根茎,属土家族珍稀药物资源。竹节参含多种三萜皂苷、多糖、丰富的氨基酸及微量元素等活性物质,兼具北药人参滋补强壮和南药三七活血化瘀之功效,是一种药食两用的天然植物,在临床治疗及保健功能上均具有广泛的应用价值。目前对竹节参的研究主要集中在治疗类风湿性关节炎药物的开发上,竹节参总皂苷(Total saponins of Rhizoma Panacis Japonici,TsPJ)微波提取、大孔吸附树脂纯化工艺研究尚未见文献报道,而其体外抗肿瘤活性方面罕有文献报道。为了充分利用竹节参资源,开发以TsPJ为主要成分的新的药物和新的中成药制剂,本课题建立了TsPJ的含量测定方法,提出了适宜于TsPJ提取和纯化的最佳工艺条件,并对其体外抗肿瘤活性作了初步的探索。主要研究内容和结果如下: LTsPJ的含量测定 选用人参皂苷Re为标准品,采用分光光度法,以5%冰乙酸-香草醛溶液和高氯酸为显色剂,在552nm处测定吸光度。以人参皂苷Re的量(μg)为横坐标,以吸光度(A)为纵坐标,制作标准曲线,经计算得回归方程为Y=0.0046X-0.0013(R2=0.9997),在40.48-202.40μg范围内线性关系良好,以此计算TsPJ的含量。经方法学实验结果显示,在90min内吸收值稳定,RSD为1.42%,精密度和重现性良好,RSD分别0.75%和1.51%;平均回收率为100.46%(n=5),RSD为1.06%。此法简便灵敏,重现性良好,方法可靠,可作为竹节参总皂苷的定量方法。 2.TsPJ提取工艺的优选 以TsPJ转移率为考察指标,在单因素实验的基础上,运用正交实验设计,筛选最佳微波提取工艺;并将其与加热回流提取法及超声提取法进行比较。结果表明,以80%乙醇为提取溶剂,微波功率400W,料液比1:18,提取4次,每次提取5 min,TsPJ的转移率可高达97.77%。微波提取工艺具有效率高、时间短、能耗低、环保等优点,为TsPJ的工业化生产和新药开发提供了依据。 3.TsPJ纯化工艺的优选 采用静态吸附和动态吸附考察相结合的方法,筛选了5种不同性质的大孔树脂,最终初步确立了D-101型大孔树脂分离TsPJ的纯化工艺:上样浓度为0.2 g生药·mL-1,PH值为6,径高比为1:10,以3BV 70%乙醇溶液洗脱,吸附及洗脱流速均为1mL·min-1。研究结果表明,未纯化前总固物中总皂苷的含量为24.36%,纯化后总固物中的TsPJ含量为82.53%,精制度达338.81%,且转移率可达88.02%。从精制度、转移率等方面考虑,该工艺适宜于TsPJ的分离及纯化。 4. TsPJ对肝癌HepG2细胞凋亡作用的考察 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)还原法检测不同浓度的TsPJ对肝癌HepG2细胞增殖的作用;流式细胞仪分析肿瘤细胞凋亡率。结果表明,TsPJ可抑制肝癌HepG2细胞生长,且呈浓度、时间依赖关系。用50、100、200和400μg·mL-1 TsPJ处理细胞48h后,发现TsPJ可诱导细胞凋亡,凋亡率与对照组比较明显升高(P0.01)。TsPJ抑制肝癌HepG2细胞生长,其机制可能是通过诱导凋亡来发挥作用的。


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