麦胚抗氧化肽RVF对SH-SY5Y细胞氧化损伤的保护作用及其机理研究

【摘要】：氧化应激是引起衰老和神经退行性疾病的主因。正常条件下,人体内拥有一套完整的抗氧化系统以维持自由基的动态平衡,一旦自由基产生过多或由于功能障碍导致抗氧化防御系统清除能力不足时,过剩的氧自由基将参与生物大分子的氧化并引起机体的氧化损伤。若及时补充外源性抗氧化剂,可加速体内自由基的清除、抑制机体的氧化损伤。目前已有报道证实麦胚多肽在体内外具有一定的抗氧化能力,但研究多局限于体外发光法检测或传统的动物实验方面,缺乏抗氧化肽对氧化损伤保护机制的深入研究。因此,本论文拟采用H202作为诱导剂,人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y为载体,探讨麦胚抗氧化肽的神经保护作用及其作用机理。论文首先对近年来已分离鉴定出的麦胚抗氧化肽进行制备和筛选,结果表明麦胚抗氧化肽RVF对细胞氧化损伤保护效果最好,故选取作为进一步的研究对象。为深入了解麦胚抗氧化肽RVF的抗氧化机理,本实验利用H202建立了SH-SY5Y细胞氧化损伤模型,从细胞存活率、乳酸脱氢酶(1actate dehydrogenase,LDH)释放率、细胞形态学观察RVF对H202诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的保护作用,结果表明RVF预孵育后可将细胞存活率提高18.02%、LDH释放率降低20.00%、细胞形态也得到显著改善。通过比色法检测了细胞内总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)的含量,结果显示麦胚抗氧化肽RVF预处理后细胞内总抗氧化能力提高了27.33%、MDA含量也显著下降。通过流式细胞术检测了细胞内氧自由基(reactive oxygen species, ROS)生成、线粒体膜电位以及Ca2+稳态的变化,结果表明RVF预处理后能够有效抑制ROS的生成与聚集、恢复线粒体跨膜电位及维持Ca2+稳态。采用Hoechst 33342和PI核染色法检测了细胞的凋亡率和形态变化,结果显示RVF预孵育后能改善细胞的凋亡形态,抑制凋亡小体的形成,细胞凋亡率下降10.81%；采用采用蛋白质印记(western blot)检测了SH-SY5Y细胞内相关凋亡蛋白Bcl-2、 Bax、PARP、caspase-3的表达量,结果发现RVF预孵育后能够显著促进Bcl-2的表达、抑制Bax的表达；Bcl-2/Bax的比值虽然在低浓度变化不大,但在中高浓度时提高了18.67%和24.97%；RVF还进一步抑伟caspase-3的激活及其对底物PARP的切割。实验结果表明麦胚抗氧化肽RVF可通过抑制H202诱导的神经细胞凋亡发挥保护作用。本研究结果表明麦胚抗氧化肽RVF对H202诱导神经细胞的氧化损伤具有显著的保护作用,其保护机制包括提高细胞内的总抗氧化能力、抑制脂质过氧化反应和细胞内ROS生成、维持线粒体跨膜电位和Ca2+稳态、增加抗凋亡蛋白的表达并阻止线粒体通路的激活等,因此,可将麦胚抗氧化肽作为食品或医药领域潜在的抗氧化剂进行开发。