拟南芥SDL基因的分离与功能互补验证

【摘要】：在前期研究中,通过甲基磺酸乙酯(EMS)对拟南芥野生型Columbia(Col-0)诱变处理,筛选获得一个短日照依赖型模拟病斑突变体,命名为sdl(short-day-dependent lesion mimic mutant, sdl)。该突变体在长日照下表型与野生型没有明显差别,而在短日照条件下表现出植株矮小,叶片和顶端花序有随机分布的病斑。通过图位克隆把SDL基因定位在180Kb范围内的两个BAC质粒上。 本实验采用亚克隆方法进一步分离克隆SDL基因。用限制性内切酶将两个BAC质粒酶解成小片段,连入双元表达载体pCAMBIA1301,共获得35个片段的阳性克隆。将这35个克隆转化拟南芥sdl突变体,通过抗性筛选均获得一定数量的转基因植株。转基因植株经过短日照处理,只有一个片段克隆的全部转基因植株与野生型植株相同,不产生病斑,而其它的转基因植株和sdl植株均有病斑表型。测序结果显示：在sdl突变体中,该片段内有1个基因发生了点突变,推测可能是该基因突变导致形成模拟病斑。初步将该基因确定为SDL基因。 为了验证SDL基因的功能,通过PCR从野生型中扩增出该基因的全长序列,并连入双元表达载体pROK2,转化sdl突变体后获得16株转基因苗。短日照处理后,16株转基因苗均没出现病斑表型,证明了是SDL基因突变导致病斑产生。 SDL基因是未报道的新基因,因此,该基因的分离对深入研究模拟病斑形成的分子机理具有重要的科学意义。