草鱼肠道β-防御素克隆表达及抗菌活性分析

【摘要】：防御素不仅作为抵御微生物入侵的第一道屏障在肠道中发挥重要作用,而且也是一种先天免疫系统的重要组成部分。防御素是一类平均分子量为3.5～6kDa的具有广谱抗菌活性的短肽,通常由29～54个氨基酸组成,富含半胱氨酸和精氨酸,表现出较强的阳离子特性与热稳定性,是天然宿主识别微生物的基础。防御素的生物活性多样,具有广泛杀菌活性,对细菌、真菌、病毒、寄生虫等多种微生物都具有杀伤作用,还具有细胞毒性和免疫细胞有趋化功能.调节机体的免疫系统。 根据斑马鱼(Danio rerio)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss) beta-defensin-like2(defbl2) mRNA (GenBank序列号NM_001081554.1, NM_001195168.1)和石斑鱼的beta-defensin gene(GenBank序列号：JN698964.1),进行序列的多重对比,发现三个序列具有高度同源性,设计特异性引物,以草鱼肠道总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增出了160bp草鱼β-防御素的基因,对防御素基因进行克隆并对克隆载体及pET-32a载体双酶切后进行连接,构建了高效原核表达载体pET32-GBD。将重组质粒转化入大肠杆菌表达菌BL21中进行表达,SDS-PAGE电泳和Western Blot分析表明GBD重组蛋白分子量大约为22kDa,并具有抗原性。通过Ni2+亲和层析方法纯化GBD重组蛋白,蛋白纯度均在95%以上。而经肠激酶酶切以后的重组防御素只有5KD,对其抗菌活性和GBD抗菌谱进行了分析,发现其对沙门氏菌、嗜水单胞菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌、鱼害粘球菌都有明显的抑制作用。证明草鱼肠道β-防御素具有广谱抗菌活性,对革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌均有抗菌效果。