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短乳杆菌M8菌株的筛选及其slpM基因的克隆与表达研究

肖荣  
【摘要】:S-层蛋白(surface layer proteins, Slps)是由单一的蛋白或糖蛋白亚基构成的晶体状结构,具有保护细胞免受外界环境的侵害,控制营养的代谢与转运,赋予细胞的吸附与表面识别能力等功能。Slps存在于几十种微生物当中,但仅少数几种乳杆菌存在这种蛋白,含Slps的乳酸菌菌株资源显得尤为匮乏,而且,目前国内外对乳杆菌Slps的研究主要集中于几株固定的模式菌株,对Slps结构及功能方面的研究也不尽透彻。基于此,本研究以Slps为筛选指标,从6种乳酸菌菌群丰富的生理环境中分离乳杆菌,获得富含Slps的短乳杆菌M8菌株,对该菌株的生物学特性进行研究,同时对Slps蛋白自组装超分子结构进行初探,最后对Slps编码基因slpM进行了克隆、表达及预测分析。所取得的一些研究结果如下: 1.筛选及鉴定含Slps的乳杆菌菌株 采用SL培养基从6种基质中筛选到8株Slps菌株,其中5株菌存在Slps,经鉴定:这5株菌分别归属为3个不同的种,即:罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和短乳杆菌(Lactobacillus brevis),分别命名为:Lactobacillus reuteri Y4、Lactobacillus reuteri Y6、Lactobacillus plantarum P4、Lactobacillus brevis C7、Lactobacillus brevis M8。结合形态特征、SDS-PAGE图谱及序列分析结果表明菌株Y4、Y6为同一种菌,二者能产生多种Slps,且含量较高;菌株P4、C7、M8均能分泌某单一的Slps,而且C7和M8均能大量分泌某单一Slps,但经传代20次以后,菌株M8的Slps产量和分子质量均十分稳定,因此,后续研究以L.brevis M8菌株为研究对象。 2.分析Lactobacillus brevis M8菌株及其Slps的生物学特征 在模拟宿主体内消化道微环境条件下,菌株M8及其Slps表现出良好的消化酶耐受能力与显著的黏附特性。 人工胃液处理后,菌株M8的活菌数对数值由8.18降低至7.01,但存活率仍大于60%,其10倍稀释液再经人工肠液处理,活菌数呈现增殖趋势;SDS-PAGE检测胃蛋白酶液和胰蛋白酶液分别处理过的M8菌体细胞,发现菌体细胞上仍然含有大量Slps未被消化;这些结果表明:分布于细胞壁外层的Slps起到天然屏障作用,使得菌体细胞能够有效地抵抗消化酶的侵袭。 采用体外Caco-2细胞模型模拟宿主小肠上皮细胞层,评价M8菌株的黏附能力。结果发现含Slps的M8菌体细胞相互聚集,并且能够黏附到Caco-2细胞周围,而经去除了Slps或经封闭了Slps活性位点的菌体细胞,黏附能力则明显受到干扰,这揭示了Slps与该菌株的黏附过程密切相关。 3.纯化M8菌株的Slps 采用葡聚糖凝胶SephadexG-75凝胶过滤柱层析法能够获得PAGE纯的Slps,该蛋白具有微生物Slps的普遍特征。 在凝胶过滤层析柱实验条件下,于第52min (Rt=52min)出现最高吸收峰,获得馏分,经SDS-PAGE检测,分子质量大小与目的Slps一致,条带单一,纯化效率为82.22%。氨基酸组成分析结果显示:M8菌株的Slps不含蛋氨酸(Met)和胱氨酸(CyS),亲水氨基酸和疏水氨基酸含量比重相当,为30%左右,带正电的氨基酸(His、Arg)含量较高,这些特征与其他微生物SlpS一致。 4.探测Slps表面形貌及免疫原性 采用原子力显微镜(AFM)直观地探测了M8菌株的Slps自组装超分子结构的二维形貌,同时对Slps免疫原性进行了初步探讨。 经AFM轻敲模式扫描测试发现:M8菌体细胞表面皱突不平,呈现出若干小颗粒状的形貌;Slps单体分子在Tris-HCl缓冲液中所形成的超分子,为中间内凹的“近圆团簇”结构,且属于纳米级尺度多的晶体结构;这些团簇结构能够进一步聚集成200nm-500nm不等直径尺度的“花朵状”晶体结构。这些超分子晶体的孔隙结构与粗糙状态,使得Slps具有庞大的表面积,从而具有很强吸附能力。 以M8菌株Slps为抗原,免疫新西兰大白兔,获得多克隆抗血清,ELISA检测该兔抗血清效价值为空白值18倍以上,效价极高。且western blotting结果显示Slps多克隆抗体与靶标Slps反应呈强阳性,表明菌株M8的SlpS免疫原性强、反应原性强; 5.克隆与表达Slps编码基因‘'slpM" 结合采用通用引物和新设计引物,即P1、P2和1f、1416r,经二步PCR扩增,获得基因slpM (GenBank登录号为:JQ063472),成功构建了"slpM-pQE30"原核表达载体,实现了slpM在E.coli JM109中的异源表达,将重组的Slps命名为"SlpM". 6.预测蛋白"SlpM"的结构与功能 经一系列生物信息学软件分析,slpM基因编码蛋白"SlpM"理论分子质量为49.96kD;极性氨基酸与非极性氨基酸含量相当;不含Cys, Met含量极低,因此S-S键形成的可能性很低;碱性氨基酸如Lys的含量使得SlpM的pI值高达9.5,这些预测结果与M8菌株Slps实测结果相吻合。 SlpM二级结构由若干β-折叠、无规则卷曲和少数几个α-螺旋构成;N-端前30位氨基酸残基构成了SP序列,起跨膜功能使Slps分布到了细胞壁外层。 SlpM蛋白N-端部分序列匹配到源自单核增生李斯特氏菌侵袭蛋白"InlB"的GW结构域,由于二者均为细胞表面蛋白、以非共价键结合在菌体细胞表面、能够黏附宿主细胞,因此,该结构可作为SlpM及其同源蛋白N-端空间结构的雏形。 上述研究结果丰富了Slps乳杆菌资源,为L.brevis M8菌株及其Slps开发利用提供了理论依据。


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