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米渣霉菌发酵产物分离鉴定及抗氧化活性研究

田蔚  
【摘要】:我国是稻谷的生产大国,年产量在2000亿公斤左右。我国的稻米除了供应人们的日常粮食需求外,很大一部分低值大米被用作淀粉糖生产和工业发酵,产生了大量的副产物。米渣是大米淀粉糖生产、有机酸发酵和味精生产的副产物,蛋白质含量高达40%以上,是非常理想的蛋白质资源。此外,米渣中还含有丰富的糊精和多聚糖,极有开发利用价值。本研究以米渣为原料,利用霉菌固态发酵,经超滤、凝胶层析和RP-HPLC进行分离纯化,获得高抗氧化活性产物,并进行结构鉴定。主要研究结果如下: 1首次选用米曲霉(Aspergillus oryzae)、根霉(Rhizopus oligosporrus)、毛霉(Mracemosus)、黑曲霉(Aspergillium niger)、青霉(Penicillium glaucum)分别对米渣进行固态发酵制备抗氧化产物。测定米渣发酵产物(RRFPs)的还原力,清除DPPH自由基、ABTS自由基、OH自由基以及抗脂质过氧化能力等体外抗氧化活性,并建立细胞氧化损伤模型,通过MTT比色法,考察各RRFPs的体内抗氧化活性,筛选出黑曲霉为最佳发酵菌种。对上述5种霉菌发酵产物进行成分分析,结果表明各发酵产物均具有较高的水解度,并结合米渣基本成分分析,初步推断米渣发酵产物的抗氧化性可能主要是后发酵过程中米渣蛋白水解产生的小分子肽表现出来的。 2首次以黑曲霉为发酵菌种,以成曲的蛋白酶活性和糖化酶活力为评价指标,通过单因素试验得出前发酵期的最佳工艺条件为:米渣含水量45%,发酵周期3天、发酵温度32℃。通过后发酵期的单因素试验证实发酵温度、发酵时间、加水量对黑曲霉发酵产物(RRFPsⅣ)抗氧化活性和水解度具有显著影响,适当的水解度下RRFPsⅣ具有较高的抗氧化活性。以DPPH·清除率为指标,采用Box-Beknken响应面对各因素水平进行模型拟合,其回归方程为:Y=53.62-0.82X1-0.85X2+0.40X3-2.55X12-2.86X22-1.55X32+0.99X1X2-0.71X1X3。经MINITAB16软件分析获得黑曲霉对米渣固态发酵制备抗氧化产物的最佳工艺条件为:温度40.4℃,时间5.5d,加水量83.4mL/10g米渣,RRFPsIV对DPPH·清除率Y值的预测为53.81%。验证试验获得的RRFPsIV对DPPH·清除率为53.56%,水解度为38.92%。 3研究了RRFPsⅣ抗氧化的稳定性以及与其它天然抗氧化剂的协同作用。结果表明,温度、酸碱度、胃蛋白酶水解对RRFPsⅣ抗氧化活性无显著影响,Cu2+、Fe3+对RRFPsⅣ抗氧化活性具有显著影响。RRFPsⅣ与VC、茶多酚复配,具有很好的抗氧化协同增效作用;与VE复配则无明显协同增效作用。4利用10KDa的超滤膜对RRFPsⅣ进行了膜分离,DPPH·(?)青除率检测结果表明:10KDa以下组分的DPPH·清除率为64.98±3.45%,高于10KDa以上组分的DPPH·清除率。利用紫外光谱检测10Kda以下组分,在210nm处有最大吸收峰。10KDa以下组分经SephadexG-25凝胶层析色谱分离成F1、F2和F3三个组分,其中F2组分的DPPH·清除率为74.71±2.66%。利用制备型RP-HPLC将F2组分分离成5个主要组分,其中F2d组分和F2e组分的DPPH·(?)青除率较高,分别达到77.37±1.01%和83.04±1.69%。采用分析型RP-HPLC进行纯度分析表明F2d组分和F2e组分为相对单一峰,峰面积分别为90.36%和91.69%。 5首次采用MicroTOF-QII串联质谱对分离纯化后的F2d组分和F2e组分进行分子量及结构式鉴定,得到分子量分别为1072.97Da和1130.5132Da的小分子多肽;从N端开始排序,其氨基酸序列分别为:Val-Ala-Glu-Glu-Glu-Leu-Gly-Gly-Asn-Arg;Leu-Asp-Pro-Glu-Gly-Thr-G1y-Thr-Phe-Pro-Pro


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