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芒草驯养湘西黄牛(Bos taurus)瘤胃微生物多样性及β-葡萄糖苷酶新基因的克隆与表达研究

李亚丹  
【摘要】:自然界含有丰富的微生物群落参与物质和能量循环,自Pringsheim等首次在土壤中分离出可降解纤维素细菌之后,关于可降解纤维素的各种微生物及其产生的纤维素酶的研究取得了很大进展。当前,研究证实牛、羊等反刍动物的瘤胃中蕴含着丰富的木质纤维素降解微生物,因此对反刍动物瘤胃微生物的研究逐渐成为探索纤维素有效降解途径的新方向。并且由于瘤胃微生物的种类与数量和宿主动物的日粮成分关系紧密,增加日粮中的木质纤维素含量对于开发纤维素降解酶具有很大的辅助作用。 本文通过构建16S rRNA和18S rRNA基因文库以及瘤胃总微生物宏基因组文库的方法,对芒草驯养后的湘西黄牛瘤胃细菌、古菌、真菌多样性进行了分析和比较,对瘤胃微生物总DNA宏基因组文库进行功能筛选,并对筛选得到的具有β-葡萄糖苷酶活性的基因unglu135B12进行原核表达,获得研究结果如下: 第一,通过构建芒草驯养后瘤胃微生物16S rRNA和18S rRNA基因文库来分析饲喂芒草对瘤胃细菌、古菌、真菌多样性的影响,结合与混合饲料喂养牛瘤胃微生物多样性的比较,发现持续喂养芒草18个月后,牛瘤胃细菌中拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)的比例发生明显改变,拟杆菌门比例由16.33%上升到28.15%,厚壁菌门比例由68.88%下降到60.92%。另外,变形菌门(Proteobacteria)和未培养细菌的比例也发生改变;瘤胃古菌的组成有明显改变,在混合饲料饲养牛瘤胃内的古菌以产甲烷菌为优势种,甲烷微菌纲(Methanomicrobia)比例为57.14%;而经过芒草驯养的牛瘤胃内产甲烷菌的比例大幅下降,优势种群被热原菌纲(Thermoplasmata)取代,甲烷微菌纲只占古菌总量的13.09%;瘤胃真菌也发生较为明显的变化:混合饲料饲养牛瘤胃真菌比对信息所包含的种类较分散,无明显的优势类别,而芒草单一喂养牛瘤胃真菌包含的种类相对集中,主要集中在Orpinomyces sp., Piromyces sp., Neocallimastix frontalis, Microdochium sp.几种。 第二,以pCC2Fosmid Vector为载体,构建了瘤胃微生物总DNA宏基因组文库。文库包含20160个克隆,外源插入片段长度范围在23-38.5kb之间,平均插入片段长度为30.23kb,估算库容量达到595.2Mb。且随机挑选克隆进行连续传代培养,从第四代的菌液中提取的质粒仍与第一代的酶切带型一致,证明文库稳定性强。此宏基因组文库适合大规模的微生物功能基因筛选。 第三,应用功能筛选法筛选宏基因组文库中具有p-葡萄糖苷酶的克隆,得到一个功能活性克隆,编号为135B12。对此克隆包含的外源片段进一步进行亚克隆,最终获得一段3470bp的核苷酸序列,经过生物信息学软件预测分析,该片段包含长为2340bp的ORF,将该基因定名为unglu135B12,编码779个氨基酸,该基因编码蛋白unglu135B12的分子质量为84162.2Daltons,等电点pI为6.00,且在其氮端1-19个氨基酸很可能为该蛋白的信号肽序列。进一步分析其与已知相似序列的系统发育关系可知,该蛋白很可能是拟杆菌属来源的蛋白。与NCBI数据库中已报道的p-葡萄糖苷酶或糖苷水解酶家族3成员最高相似度仅在56%-62%,说明该基因具有很高的新颖性。对该重组蛋白进行酶学性质研究发现:其最适反应温度为38℃,在30℃放置1h,酶活仍然能保持85%以上,但对40℃以上的温度稳定性较差;最适pH为5.0(最适温度、pH条件下的比活力为2.5×103U/mg),在pH5.0-6.5条件下放置24h,残余酶活力仍保持在60%以上;金属离子Ca2+、K+、Na+对该酶具有较强的促进作用,Mg2+对酶活力基本无影响,而Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+对酶活力具有抑制作用;利用双倒数法计算unglu135B12的Km和Vmax分别为0.314mmol/L和7.188μmol/min。 本文研究结果表明,通过芒草驯养的方法,能够促使湘西黄牛瘤胃微生物群落向更有利于纤维素降解的方向变化;利用宏基因组文库技术成功筛选到p-葡萄糖苷酶基因unglu135B12,该基因所编码的蛋白质unglu135B12具有较好的β-葡萄糖苷酶活性,为进一步研究芒草纤维素的开发利用提供了有利条件。


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