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猪小肠NaPi-Ⅱb基因克隆和表达调控研究

项智锋  
【摘要】:磷污染和磷资源短缺是现代养猪业面临的两大严峻问题。消化层次上,通过提高植酸磷的利用率,优化猪日粮磷的配制等措施,在降低粪磷排放方面已取得了一定效果;但在吸收层次上,我们对磷在猪体内的代谢,包括磷在小肠中吸收的分子机制方面了解不多。钠依赖型无机磷转运蛋白NaPi-IIb被认为是在动物小肠中调节无机磷跨膜转运的最重要的通道蛋白,但猪小肠NaPi-IIb基因分子特性、调控机理研究还处于探索阶段,尚无该基因cDNA全长序列的报道。本论文研究的目的在于探明NaPi-IIb的分子特性,并诠释该基因在小肠磷吸收调控中的作用机制。在研究方法上,通过利用RACE技术克隆猪NaPi-IIb基因全长cDNA序列,在生物信息学手段分析其生物学特性及功能基础上,运用Real-time PCR技术及Western blot技术,从转录水平及蛋白表达水平初步探讨NaPt-IIb基因的信号调控通路。主要结果如下: 1.成功克隆了猪NaPi-IIb基因全长cDNA序列,并对NaPi-IIb蛋白分子特性进行了分析 从NaPi-IIb基因的保守序列出发,设计特异性引物,RT-PCR扩增猪NaPi-IIb基因核心序列。参照该核心序列设计RACE技术所要求的两条特异性引物GSP-1与GSP-2,进行猪NaPi-IIb基因3'RACE与5'RACE扩增,产物序列经DANMAN软件拼接,获取猪NaPi-IIb基因全长cDNA序列。序列递交NCBI获得序列号:NM001256772.1。生物信息学方法分析表明:猪NaPi-IIb基因全长cDNA序列由2571bp核苷酸组成,有一个完整的2016bp开放阅读框,编码相对应的671个氨基酸,包含157bp5'-UTR区和398bp的3’-UTR区。其编码区包含12个外显子和]1个内含子,对应猪8号染色体19832502nt~19846222nt位点,内含子符合GT/AG法则:通过GenBank同源性比对发现,该基因全长cDNA序列与牛(HQ709136.1)、绵羊(XM004009749.1)、马(XM001499463.1)、人(NM001177998.1)、小鼠(AK004832.1)基因核苷酸序列同源性分别为84%、84%、83%、81%、81%,score值依次为1847、1825、1736、1714及1]90,与已报道的猪部分cds序列(DQ219469.1)比较,同源性为99%,score值为894,显示出NaPi-IIb基因分子进化上高度的保守性;WU BLAST2在线程序分析发现所推导的编码的NaPi-IIb氨基酸序列与牛(DAA28794.1)、牦牛(ELR55433.1)、马(XP001499513.1)、猫(XP003985529.1)、家鼠(NP445832.1)、狗(XP545968.2)及人(NP001171469.1)氨基酸序列相似性介于84%-88%之间,表明该基因功能与NaPi-IIb相关;系统进化树表明,所获得的基因与牛、人及大鼠等哺乳动物亲缘关系较近,而与鱼及鸡较远;跨膜结构域预测显示,该蛋白包含9个跨膜结构域,1-71氨基酸残基为信号肽区域,且295-340氨基酸位点存在5个NaPi-IIb氨基酸活性位点保守序列PDZ区,613-645氨基酸位点存在5个富含半胱氨酸位点,符合NaPi-IIb分子家族结构特性;采用PHD在线程序及SWISS-MODEL软件对猪NaPi-IIb蛋白高级结构特性预测分析显示,该蛋白富含α-螺旋,并与β-折叠在分布区段交替存在,存在较少的β-转角。 2.从组织及细胞水平探讨了猪NaPi-IIb基因转录调节的影响因素 采用Real-time PCR实验技术,本研究系统探讨了小肠区段、雌激素与糖皮质激素对猪NaPi-IIb转录水平的差异和影响。溶解曲线显示NaPi-IIb基因PCR产物溶解曲线峰值(Tm)在78℃左右,内参β-actin基因溶解曲线峰值(Tm)在82℃左右,溶解曲线峰单一明显,无其它非特异性产物峰出现,扩增曲线光滑,呈典型的S型;对NaPi-IIb基因在猪小肠不同肠段的转录检测表明,小肠各区段NaPi-IIb mRNA表达无明显差异;以猪小肠上皮细胞为研究对象,从细胞水平检测雌激素和糖皮质激素对NaPi-IIb转录的影响,结果表明,高浓度雌激素(1×10-7μg/mL)增加了NaPi-IIb mRNA表达量,而不同浓度糖皮质激素(1×10-11μg/mL、1×10-7μg/mL、1×10-9μg/mL)均抑制NaPi-IIb mRNA表达;对不同激素干预后细胞上清中磷含量进行检测,结果显示高浓度雌激素组细胞上清液磷含量明显下降,提示该浓度条件下雌激素通过刺激猪小肠.上皮细胞中NaPi-IIb基因表达,诱导细胞外液磷跨膜转运进入细胞内液:对于糖皮质激素,与对照组比较,高浓度组细胞上清液磷含量与对照组比较差异不显著(P0.05),而低中浓度组细胞上清液磷含量均出现明显降低(P0.05),提示糖皮质激素对磷的跨膜转运可能是除NaPi-IIb基因以外其它因子所主导。 3.从基因转录及蛋白表达水平,探讨了mTOR信号通路在雌激素对NaPi-IIb分子调节过程中的作用机制 采用Real-time PCR实验技术,探讨了mTOR阻滞剂rapamycin及PI3K阻滞剂LY294002对猪小肠上皮细胞NaPi-IIb基因转录的影响,结果表明,rapamycin与LY294002均抑制1×10-7μg/mL雌二醇对NaPi-IIb基因转录的上调作用,提示mTOR蛋白及其上游调节蛋白PI3K参与到对猪NaPi-IIb基因转录的调节:以Real-time PCR技术检测了猪小肠上皮细胞雌二醇受体基因ESR、NaPi-IIb基因、mTOR基因及4EBP1基因转录活性,结果表明,与对照组比较,不同浓度雌二醇均显著或极显著增加mTOR基因、ESR基因转录(P0.05or P0.01),而1×10-7μg/mL及1×10-6μg/mL雌二醇极显著增加NaPi-IIb基因的表达(P0.01),提示雌二醇能够通过与体内受体的结合,通过增加mTOR基因的转录水平来上调NaPi-IIb基因的表达;采用Western blot技术,探讨药物干预对小肠上皮细胞NaPi-IIb蛋白表达影响,结果显示,mTOR抑制剂及PI3K抑制剂均明显降低NaPi-IIb蛋白的表达,说明mTOR蛋白参与到雌二醇介导的NaPi-IIb蛋白表达的调节:检测不同浓度雌二醇对mTOR通路相关蛋白表达影响,结果表明1×10-8μg/mL、1×10-7μg/mL及1×10-6μg/mL雌二醇组显著增加了]mTOR上游调节蛋白p-PI3K的表达(P0.05),而1×10-7μg/mL及1×10-6μ/mL雌二醇组显著增加了下游调节蛋白4E BP2及p-p70S6K的表达(P0.05);对]mTOR通路相关蛋白在小肠上皮细胞中时效性表达分析表明,在1Omin~30min内,细胞各蛋白的表达量呈现较明显的升高,而30min后呈下降趋势,90min时各蛋白均出现较明显的降解;以1×10-7μg/mL雌二醇处理猪小肠上皮细胞10min,mTOR信号通路各蛋白相对表达量与NaPi-IIb蛋白表达量相关性分析表明,NaPi-IIb蛋白与p-PI3K蛋白及4EBP2蛋白呈极显著正相关(P0.01),与p-p70S6K蛋白呈显著正相关(P0.05),说明在猪小肠上皮细胞中,1×10-7μg/mL雌二醇通过调节mTOR信号通路相关蛋白活性上调NaPi-IIb蛋白的表达。 综上所述,本研究利用RACE技术成功克隆猪NaPi-IIb基因全长cDNA序列,在检测小肠区段、雌二醇及糖皮质激素对NaPi-IIb基因转录影响基础上,提出高浓度(1×10-7μg/mL水平)雌激素对猪小肠NaPi-IIb基因转录的正向调节作用,并从转录水平和蛋白表达水平证实mTOR及其信号通路参与到雌激素对NaPi-IIbb调控机制,为探明猪小肠无机磷吸收的分子机制奠定了初步的理论基础。


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