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沼泽红假单胞菌甲氰菊酯降解基因克隆表达及特性研究

吴龙飞  
【摘要】:甲氰菊酯(Fenpropathrin)是一种人工合成的高效广谱拟除虫菊酯类仿生农药。具有药效快,击倒性强和药效持久的特点,同时在自然环境中不容易分解。随着甲氰菊酯在农业生产上的大量应用,甲氰菊酯的农药残留问题,越来越受到大家的关注。本研究利用前期分离到的降解甲氰菊酯菌株沼泽红假单胞菌PSB-S,对其降解基因进行克隆,成功克隆到三个降解基因Est3384, Est3385和Est3706,氨基酸序列系统发育树分析,三个降解酶基因分别属于酯酶超家族中的家族Ⅰ、Ⅷ和ⅡI。将这三个基因构建于pGEX-3x原核表达载体,获得了pGEX-3X-3384、pGEX-3X-3385、 pGEX-3X-3706三个重组质粒,导入E.coli Rosetta,进行降解酶蛋白的原核表达。三个降解酶蛋白的最优表达条件为35℃,IPTG浓度0.7mmol/1。诱导表达获得了三个55kDa的可溶性蛋白(目的蛋白加上GST标签)。蛋白纯化和Western blot验证结果表明,三个降解酶蛋白均为目的蛋白。三个降解酶蛋白的降解动力学和降解特性分析表明,三个降解酶蛋白最佳降解甲氰菊酯的条件为35℃,pH 7.0。三个降解酶蛋白均能降解7种不同的菊酯类农药,Est3385的最佳底物为甲氰菊酯,Est3384和Est3706的最佳底物为甲氰菊酯和氯氰菊酯,三个降解酶蛋白的降解效率均受到金属离子的抑制。本研究的原核表达的降解酶蛋白,为甲氰菊酯农药残留物的生物修复提供了新的资源,同时为构建高效降解甲氰菊酯工程菌提供了理论依据。


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