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中药对猪源大肠杆菌耐药性消除作用的研究

彭苗苗  
【摘要】:随着抗菌药物在畜牧业的广泛及不规范使用,细菌耐药性尤其是多重耐药性日益增强与流行,不仅给畜牧业造成巨大损失,加大了人类和动物细菌疾病的防控难度,而且还将威胁到人类的生命安全。许多数据显示我国大肠杆菌的耐药形势更为严峻,大肠杆菌耐药质粒、耐药基因及相关遗传机制有不少研究,但中药对其耐药性的消除方面缺乏细致深入的描述。本研究从病猪活体分离大肠杆菌,通过药敏试验筛选出耐药性较强的9株大肠杆菌,使用纸片法通过凝胶电泳质粒电泳图谱法对9株大肠杆菌的质粒进行检测,使用λDNA/HindⅢ作为marker建立标准曲线,从而计算出各大肠杆菌质粒条带的大小;使用PCR检测喹诺酮类耐药基因GyrA和ParC、四环类耐药基因TetA和TetB。结果显示:9株猪源大肠杆菌对18种抗生素具有不同的敏感程度,耐药数都在7耐以上,最高为13耐,其中7株大肠杆菌对10种或10种以上的抗生素耐药,3株大肠杆菌对13种抗生素耐药;9株大肠杆菌菌株对12种抗生素的耐药率均大于50%,其中对氨苄西林、青霉素、阿莫西林、红霉素耐药率达到100%,对四环素、多西环素的耐药率为88.9%,对多粘菌素B、大观霉素、链霉素、新霉素、恩诺沙星、环丙沙星较为敏感;9株大肠杆菌质粒谱型均不相同,谱型条带大小范围约为0.574×10~3 bp-19.065×10~3 bp,所有谱型中均有一个大小约为19.065 Kbp的条带,提示这些大肠杆菌的质粒具有遗传学上的同源性,这些大肠杆菌可能处于同一流行或拥有共同来源;9株大肠杆菌均检测出GyrA、ParC、TetA和TetB共4种耐药基因。使用改良的影印培养法研究七种中药在亚抑菌浓度下对9号大肠杆菌的消除作用,设置十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)组和空白组,在24 h、48 h和72 h三个时间点分别记录各组的耐药消除率,各组的消除试验在每个时间点均做三次重复试验。在72 h的消除试验过后,分别对各中药消除子进行药敏试验、凝胶电泳检测质粒电泳图谱、PCR检测各消除子的耐药基因。研究结果显示:(1)七种中药消除组在三个时间点的消除率范围是0.9%-57.9%,不同中药对大肠杆菌的耐药性消除作用在24 h、48 h和72 h三个时间点均不相同。(2)六种中药耐药消除子恢复了1-4种抗生素的敏感性,板蓝根耐药性消除子耐药表型未发生变化,在一定程度上,中药消除试验后逆转为敏感的抗生素数量与中药对大肠杆菌的抑菌效果呈正比。(3)六种中药耐药消除子的质粒电泳图谱丢失1-5条质粒条带,黄柏耐药消除子的质粒电泳图谱未发生改变;丢失了大小约为574 bp的质粒条带的消除子均恢复了对喹诺酮类抗生素的敏感性,说明大小约为574 bp的质粒条带与大肠杆菌对喹诺酮抗生素的耐药性有关;同时也表明大肠杆菌的耐药性与耐药质粒密切相关。(4)七种中药的消除子均检测出GyrA、ParC和TetA三种耐药基因,七种中药的消除子均未检测到四环素耐药基因TetB;说明9号大肠杆菌的四环素耐药基因TetB被消除了,中药对大肠杆菌的耐药基因TetB具有消除作用。


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