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拟南芥乙酰乳酸合成酶(AtALS)基因编辑与转基因过表达抗除草剂分析

文素珍  
【摘要】:乙酰乳酸合成酶(acetolactate-synthase,ALS),又称乙酰羧酸合酶(acetohydroxy acid synthase,AHAS),是只存在于微生物和植物体内的一种酶,现已有报道ALS基因相关位点进行突变可产生抗除草剂植株。本研究利用在生殖细胞特异启动子ProDD45驱动Cas9表达的植株中转化sgRNA和供体模板的先后转化方法,对拟南芥内源乙酰乳酸合成酶(AtALS)基因进行定点突变替换,为分析不同突变位点对磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂的抗性强度和抗性组合情况做出了摸索。同时进行转基因过表达分析位点组合突变对拟南芥除草剂抗性的影响。主要取得以下研究结果:1.体外突变AtALS基因。利用重叠延伸PCR方法,分别单点和组合突变了AtALS基因四个位点(P197S、R199A和W574L、S653F)。利用CRISPR/Cas9技术介导的HDR修复途径,在AtALS基因组选择合适的sgRNA靶位点,构建成单位点或多位点替换载体,载体中同时包含U6启动子驱动的相应的sgRNA和含有碱基定点替换(P197S、R199A和W574L、S653F)的片段以及片段两端的同源臂。2.筛选拟南芥除草剂抗性植株。在ProDD45-Cas9表达植株的基础上转化我们的定点同源替换质粒,筛选抗性标记苗,进一步在T2代筛选除草剂抗性苗。还未得到除草剂抗性植株。3.绿色荧光蛋白融合的多位点突变At ALS基因过表达植物的获得。构建了四个位点(P197S、R199A和W574L、S653F)均发生突变的4mAtALS基因的过表达载体,并与GFP融合表达4mAtALS-GFP,通过农杆菌介导法获得转基因过表达植株。4.荧光体式显微镜观察过表达植株的荧光信号。4mAtALS转基因与GFP融合表达,可以通过荧光体式显微镜观察转基因植株中4mAt ALS-GFP融合蛋白的表达,发现绿色荧光信号均匀分布于拟南芥的叶,茎,根等部位,并且绿色荧光信号在T2代植物群体中有表型分离。这样可以很方便地筛选出高表达4mAtALS-GFP融合蛋白的转基因植株。5.通过Western Blot免疫印迹在蛋白水平检测到4mAtALS-GFP蛋白表达。6.磺酰脲类除草剂抗性实验表明4mAtALS-GFP过表达植株对磺酰脲类除草剂具有抗性。与对照植株相比较,转基因拟南芥在含有浓度5 ppm的苯磺隆除草剂的植株长势明显更好,且对甲氧咪草烟除草剂也有一定的抗性。其中,在喷施除草剂(Trme 25 ppm+Imazamox25 ppm)的实验中,与对照相比4mAtALS–GFP转基因过表达#48号株系植株表现出对苯磺隆除草剂和甲氧咪草烟除草剂的明显耐受性。综上,本研究对CRISPR应用于ALS基因编辑,系统分析除草剂抗性ALS突变位点做出了摸索,我们的突变位点组合转基因结果为改造ALS基因结构和提高转基因植物抗除草剂能力提供了有力依据和基础。


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