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酱香型白酒酿造过程中微生物群落组成及其与酒品质的关系

戴奕杰  
【摘要】:中国白酒历史悠久,是世界上最古老的蒸馏酒之一,现已由浓香、酱香、清香、米香四大主流香型发展为凤、兼、董、特、豉、芝麻、老白干、馥郁香等十二种香型酒。其中,以茅台酒为代表的酱香型白酒深受广大消费者的欢迎,独具一格的酿造工艺也使得其酒体香味成分无论是种类还是赋香感受上都优于其他香型酒。酱香大曲是酿造酱香型白酒的糖化剂、发酵剂和生香剂,在制曲过程中由于温度不断升高,从而训化出耐高温产香的有益微生物体系;独特的堆积工序是形成典型酱香必不可少的工艺环节,在此过程中糟醅充分利用环境中微生物和各种酶类,经复杂的生物转化、酶促褐变和美拉德反应等生化活动,逐步形成优雅而丰满的酱香风味。高温制曲和堆积发酵这两个重要工序被许多名优香型白酒生产企业所借鉴、吸收、应用和演化。本论文针对酱香型白酒酿造过程中制曲和酿酒两大关键环节,利用微生物多样性测序技术、色谱质谱等分析手段,研究从制曲到馏酒阶段的微生物群落结构特点、相关酶系、风味物质变化规律;认识酱香酒酿造中微生物群体的生态特征,分析关键的功能微生物,研究重要微生物之间的关系及其对酱酒品质的影响;探讨分析影响酱香酒品质的主要因素及特殊工艺的质量要素,为更好的提高酱香型白酒酒质和生产效率提供理论依据。试验主要结果如下:(1)采用Illumina HiSeq2500测序系统,全面剖析高温制曲、糟醅堆积和窖池发酵阶段的细菌、真菌群落结构。酱香型白酒大曲中的优势细菌有Escherichia-Shigella、Lactobacillus(乳杆菌属)、Clostridium sensu stricto 1、Streptococcus(链球菌属)、Actinobacillus(放线杆菌属)、Bifidobacterium(双歧杆菌属)、Citrobacter(柠檬酸杆菌属)等;优势真菌是Alternaria(链格孢属)、Cyphellophora、Pyrenochaetopsis(拟棘壳孢属)、Issatchenkia(伊萨酵母属)、Pichia(毕赤酵母属)、Candida(假丝酵母)等。发酵糟醅中的微生物菌群在数量及结构分布上也呈现出多样性,优势菌群种类与大曲基本一致。整体而言,制曲和制酒两个关键工序中,细菌多样性明显高于真菌,由于大曲和糟醅的生态环境之间存在差异,导致微生物优势菌的丰度存在差异。本文还利用网络分析,尝试探究微生物间的相互作用关系,Clostridium sensu stricto 1与Escherichia-Shigella、Actinobacillus(放线杆菌属)、Bifidobacterium(双歧杆菌属)及Citrobacter(柠檬酸杆菌属)呈负相关关系,与Sarcina(八叠球菌属)呈正相关关系;Escherichia-Shigella与Actinobacillus(放线杆菌属)、Citrobacter(柠檬酸杆菌属)及Enterobacter(肠杆菌属)正相关,与Clostridium sensu stricto 1、Sarcina(八叠球菌属)负相关。Lactobacillus(乳杆菌属)与Bifidobacterium(双歧杆菌属)为正相关关系。(2)运用酶联免疫法对糟醅样本中的8种酶酶活性进行检测分析,同时对优势菌与主要酶活采用聚类分析方法探讨其相关性。蛋白酶、脂肪酶、单宁酶和酯化酶影响白酒的口感和品质,α-淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、果胶酶主要影响原料利用率和产酒率。在整个制酒过程中,α-淀粉酶含量表现为规律性的上升-下降变化,而测序检测到的微生物菌群中,Clostridium sensu stricto 1也表现为相似的变化规律,说明该菌属可能直接影响淀粉酶活性,使得酿酒过程中的淀粉类物质或中间产物产生分解反应,从而影响酒的口味与风格。细菌中的Clostridium sensu stricto 1和酵母菌中的Issatchenkia(伊萨酵母属)、Pichia(毕赤酵母属)、以及霉菌中的Alternaria(链格孢属)也呈现与蛋白酶活性相似的变化趋势,即堆积发酵(下窖)时检测的含量升高,其中Clostridium sensu stricto 1在三轮次下窖时物种相对丰度达到最高值。α-淀粉酶、蛋白酶、果胶酶酶活性表现为各轮次样本堆积发酵(下窖)时高于窖池发酵(起窖),推测与堆积工艺有一定的关系,强调堆积对微生物重组后代谢产酶的重要作用。霉菌中的Alternaria(链格孢属)在各发酵时间的丰度变化与糖化酶酶活性基本一致,且在二轮次窖池发酵(起窖)后达到最高值。综合结果显示:Clostridium sensu stricto 1和Alternaria(链格孢属)作为糟醅中的优势菌分别对淀粉酶、蛋白酶、糖化酶含量产生重要影响,酶活性在7个制酒轮次中均呈现先上升后下降的变化规律。(3)应用气相色谱(GC)技术检测七轮次酒和发酵酿酒阶段糟醅样本中的风味物质,同时分析讨论了酸类和醛类物质与优势菌的相关性。整体上来看,所检测样本的四类风味物质在含量上的规律呈醇酯醛酸。轮次酒各类风味物质的总体趋势表现在第三、第四、第五轮次酒中维持较高的含量,为优质基酒的产出提供物质前提,这与理化指标检测中的结果一致。其中风味物质醇、酸、酯类物质表现为窖池发酵(起窖)含量高于高温堆积(下窖)阶段,确定了高温堆积将部分前体物质带到窖内进行分解,并在酒体中高效提取,成为轮次酒中的关键组分。酱香型白酒醇类以正丙醇含量最高,增加基酒的“爽口”感。一般认为,酿酒过程中出现的有机酸由乳酸菌等产酸菌发酵作用葡萄糖而来,糖化酶在此生化过程中起到一定的作用,酸类变化幅度较小,以乙酸含量最高。糟醅中,酯类含量最高为乙酸乙酯,其次为乳酸乙酯,两者是形成白酒独特风味的重要化合物。结合Lactobacillus(乳杆菌属)的丰度变化,推测与乙酸、乙酸乙酯和乳酸乙酯存在显著性相关。(4)根据《仁怀大曲酱香酒技术标准体系》标准,本研究对轮次酒的理化性质进行定量分析,酱香型白酒第三、第四、第五轮次酒的酒质和产量均为最佳。由蛋白酶和α-淀粉酶活性在堆积发酵(下窖)时高于窖池发酵(起窖),并结合微生物多样性分析中的优势菌属,Escherichia-Shigella、Lactobacillus(乳杆菌属)、Clostridium sensu stricto 1、Alternaria(链格孢属)等菌属的丰度变化,认为酱香酒独特的生产工艺造就了稳定的微生物区系,各优势菌属产生相应的酶,堆积为窖池发酵提供前体物质,使香味成分得到充分分解,使各轮次酒风味各具特色。(5)通过对酱香型白酒发酵酿酒阶段的糟醅和七轮次酒中氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)定量分析,结果表明EC均有检出,含量在41.07μg/kg~284.11μg/kg之间,符合《我国主要酒类中氨基甲酸乙酯的风险评估》中的限量建议400μg/kg,仅有少量样品中EC含量高于国外相关酒类限量标准。从检测结果看出,无论是轮次酒还是发酵酿酒阶段的糟醅样本,EC含量随时间的推移,整体呈现上升趋势。通过与糟醅中优势菌属的聚类分析,不仅得到了已报道过与EC形成有关的乳酸菌外,还发现了一些其他菌属,如Peptoclostridium,Actinobacillus(放线杆菌属),Turicibacter,Aquabacterium,Ramlibacter等,为白酒发酵中EC的形成途径研究提供了理论基础,同时为制定酱香型白酒相关的限量标准提供依据。


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