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转基因植物外源基因的检测方法及整合位点的研究

李少骞  
【摘要】: 由于目前科学技术水平还不能精确地预测转基因可能产生的对人类及环境的安全问题,因而,开展转基因检测、鉴定,成为各国限制转基因作物大量涌入的主要措施。转基因检测的主要目的是鉴定是否为转基因、转的何种成分、含量多少以及是否为批准进口的品种等。有关转基因检测的方法,国内外已有不少报道,但具有单一性,没有通用的筛选、鉴定方法,有关整合位点的研究国外刚刚开始,国内未见报道。 本研究根据收集的国内外已商品化的转基因作物品种,选择了能基本覆盖商品化转基因品种的7个外源基因,即:CaMV35S、FMV启动子、NOS终止子、NPTⅡ标记基因和目的基因PAT、EPSPS、CryIA(b)作为筛选目标,以植物18SrRNA基因作为内源参照基因,设计了多对特异性引物,并筛选出最佳组合,优化了检测条件和参数,建立了PCR定性检测方法体系。在此基础上,根据荧光PCR原理,设计、优化引物和荧光探针,建立了荧光PCR定性检测方法体系,并以玉米内源基因(Zein)、大豆内源基因(Lectin)作为内标基因,以EPSPS和CryIA(b)作为目的基因,建立了荧光PCR定量检测方法体系。 转基因整合位点检测是鉴定转基因品种是否为批准进口转基因作物的有效的特异性方法,国外在2000年和2001年已开展了转基因玉米Bt11、Mon810两个品种整合位点的特异性检测方法研究。本研究以华番1号为试材,利用反向PCR和荧光PCR技术已成功将华番1号转基因整合位点DNA序列扩增出来。通过验证,该整合位点DNA序列具有品种特异性,从而通过外源基因整合位点的研究建立了华番1号转基因的定性、定量检测和品种特异性鉴定方法。 本研究主要研究结果摘要如下: 1、收集了国内外商品化的转基因作物17种,并通过查阅有关文献及网站,初步分析、确定了75个品种的转基因构建成分,为开展转基因检测奠定了基础。 2、不同类型的植物提取基因组DNA的方法略有差异,本研究优化了CTAB、SDS快速提取法,并选择了磁珠吸附试剂盒法,成功提取了适合于PCR反应的植物基因组DNA。 3、以植物内源基因18SrRNA为靶标,设计、优化后筛选出特异性引物 和探针,建立了以 18SrRNA为目标的检测植物基因组 DNA提取质量的 PCR与 荧光PCR鉴定体系。 4、首次以CaMV35S、FMV启动子、NOS终止子、标记基因NPTll、抗除 草剂基因EPSPS、PAT、抗虫基因Cry1A枷)为检测目标,设计、筛选出特异 性引物,优化实验参数,建立了转基因植物PCR定性检测方法体系,灵敏度 达0.1%。 5、克隆了CaMV35S、FMV启动子、NOS终止子、标记基因NPTll、抗除 草剂基因EPSPS、PAT、抗虫基因Cry1AO)的阳性质粒作为转基因植物检测 的阳性对照。 6、于反应体系中引入UNG酶,建立了无污染的荧光PCR扩增体系。 7、首次以 FAM荧光素标记探针 5’端作为发光基团,以 TARMA标记探针 3’端为淬灭基团,以 CaMV35S、FMV 启动子、NOS 终止子、标记基因 NPTll、抗除草剂基因EPSPS、PAT、抗虫基因Cry1A*)为检狈目标,设计、 筛选出特异性引物和探针,优化实验参数,建立了转基因植物通用性荧光 PCR定性检测方法体系。 8、以FAM和TET两种荧光素标记外源基因和内源基因,建立了转基因 大豆抗除草剂基因EPSPS和转基因玉米抗虫基因Crx1A比)的荧光PCR定量 检测体系,两体系的灵敏度均达到0.1%以上。 9、首次利用反向 PCR技术扩增出华番 1号基因组未知 DNA序列,并通过 DNA测序,利用BLAST软件进行同源性比较,找出载体与基因组整合位点DNA 序列。 10、利用荧光 PCR技术,设计出特异性引物与探针,优化实验参数,建 立了一种灵敏、精确、定量和鉴定华番1号品种特异性的高效检测体系。这 在国内为首次利用整合位点进行转基因植物检测和品种特异性鉴定的方法。


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