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几丁质酶产生菌的筛选及初步应用的研究

唐勇军  
【摘要】: 【研究背景和意义】水稻是世界上最重要的农作物之一,养育着世界近50%的人口。中国是世界最大的水稻生产和消费国,全国60%以上的人口以大米为主食,每年的总产量达2000亿公斤左右。虽然我国水稻生产已取得举世瞩目的成就,但也面临着新的挑战,粮食生产成本高、效益低、国际竞争力弱的情况依然存在。在生态环境中,影响水稻生长的因子多种多样,并且处于动态的变化中,这些环境因子一旦超出水稻忍耐的范围就成为了逆境胁迫因子,对水稻产生危害,导致了巨大的产量和经济损失。水稻病害是其主要的逆境胁迫因子之一,也是影响水稻产量和质量的重要因素之一。特别是真菌病害,具有传染快、危害大等特点。对水稻危害最大的三种病害为稻瘟病、水稻纹枯病、水稻白叶枯病,其中有两种是真菌病害,稻瘟病在流行年份可减产40%~50%,有的田块甚至颗粒无收。近几十年来,防治水稻病害的措施主要是化学防治,但是化学防治对土壤、空气及水体污染严重,破坏了生态环境的平衡。同时导致农药残留在农副产品中,严重影响了人类健康。为了达到既能有效的防治农作物病虫害,又能减少化学农药用量的目的,生物农药以及一些无害防治途径的研究与开发越来越引起广泛重视。 几丁质酶产生菌是一类能够利用几丁质作为碳源而生存、繁殖的特殊微生物种群,其生理生化方面的共同特征就是能够分泌几丁质酶,并通过这些酶的作用将几丁质降解为几丁质寡糖、几丁质二糖直至几丁质单糖。而几丁质酶和几丁寡糖在植物抗病上的应用已经被广泛的报道,而且有研究证实几丁寡糖还能促进植物的生长发育。几丁质酶产生菌是一类很有前途的抗真菌的微生物,因此,在这方面作更广泛更深入的研究是很有意义的工作。 【目的】获得对病原真菌有较好抑制效果的几丁质酶产生菌及其应用技术,初步探索拮抗菌的作用机理。 【内容】分离纯化对病原真菌有较好抑制作用的几丁质酶产生菌,优化产酶条件,研究拮抗菌株对一些病原真菌的抑菌效果,探讨拮抗菌发酵液对水稻幼苗保护酶活性的影响。 【方法】菌种筛选方法:初步分离:采用平板透明圈方法筛选几丁质酶产生菌菌株, 中文摘要 产生透明圈的培养基选用分离培养基。将土样(棉用土.稻田土、桔园土、池塘底泥、 水产养殖场的泥土等)或植物器官(水稻、棉花、玉米、烟叶及一些蔬菜的根、茎、 叶)用无菌水稀释(梯度稀释法人在稀释倍数为 10叶、10刁、10、时分别取 0.sml涂 于分离培养基中,30aC培养3~5天,观察透明圈是否产生。 二次分离:继续培养得到的菌株,同样用梯度稀释法在分离培养基中培养菌株单个菌 落,观察其在分离培养基中生长情况。根据生长情况和产生透明圈的大小选出较好的 菌株。 三次分离:在含稻瘟病病原菌细胞壁成分的培养基的平板上培养,在二次分离的基础 上,观察筛选菌株的生长情况,并检测菌株的几丁质酶话性。 微生物几丁质酶活性测定方法:参照 Ac e介绍的方法。 抑菌实验的方法:参照擅建新和李力介绍的方法。 过氧化氢酶活性测定:按照《植物生理生化实验》中介绍的方法进行。 过氧化物酶活性测定方法:按照《生化实验技术方法和技术》中介绍的方法进行。 苯丙氨酸解氨酶活性和植物几丁质酶活性测定方法:按照《现代植物生理学实验指南》 中介绍的方法进行。 【结果】 1.从自然界中筛选到两株产酶能力较强的几丁质酶产生菌,分别编号为H3和 Hg。初 步鉴定结果,H3菌株为苏云金芽抱杆菌,Hg可能为盲霉菌。 2.产酶条件:H3菌株以细粉几丁质和酵母粉为 C源和 N源,在 30aC、pH72下培养 72小时为最佳产酶条件* 菌株以细粉几丁质和酵母粉为 C源和 N源,在 35℃,pH6.9 下,培养84小时为最佳产酶条件。 3H3和 Hg菌株对几种病原真菌有明显抑制作用,H3对稻瘟病、水稻效枯病、棉花枯 萎病、小麦赤霉病、黄瓜枯萎病的抑菌率分别为 73.l%、44.3 %、62.5 %、50上%、56.3 %:*9对它们的抑菌率分别为58.2%、忙*%、56.3%、27.2%、36石%。 4.H3菌株发酵液处理水稻种子后,接种稻瘟病,培两优288出苗率、苗高、百苗干物 重分别为 31.5%,11.2上1.6cm、1.95土0 089;旱干 127出苗率、苗高、百苗干物重分 别为65 %、12.5土2.Icm、1.67土0.119;新香优80出苗率、苗高、百苗干物重分别 为42%、13.2士2,ZCm、2.06土0.149。Hg菌株发酵液处理后,培两优288出苗率、苗 高、百苗干物重分别为 33%、8*h石cm、1.87上0 069。旱干 127出苗率、苗高、百苗 干物重分别为 57.5%、11.4士2.Zcm、1.59上0 079;新香优 80出苗率、苗高、百苗干 物重分别为35%、11.5土3.ocm、2.10土0.15g。与对照相比均有明显提高。 5两株几丁质酶产生菌的产酶发酵液(含几丁质底物)能诱导水稻幼苗保护酶系活性的 改变,使其朝着有利于水稻幼苗生长和抵抗不利因素的方向发展,产酶发酵液作用比


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