籼稻成熟胚再生体系的建立及反义waxy基因转化籼稻的研究

【摘要】：水稻是我国的主要粮食作物之一,其播种面积占全部粮食作物面积的30%,产量则占粮食总产量的40%。由于粮食的不断增产和人民生活水平的提高,人们对稻米的要求逐步从量的需要转向质的要求,米饭的食味品质备受关注。湖南作为我国稻米的主要产区之一,绝大部分水稻品种的直链淀粉含量偏高,品质较差,严重影响了稻米的出口,因此,尽快改良我省稻米的直链淀粉含量已成为一项极其重要且十分紧迫的任务。运用基因工程手段培育转基因水稻为传统水稻育种和遗传改良开辟了新的途径。本研究以3个籼稻品种的成熟胚为材料,建立了适合于籼稻愈伤组织的诱导和再生体系。通过对水稻愈伤组织培养过程中的生理生化特性进行的研究,优化了农杆菌遗传转化条件,并将外源蜡质反义片段和抗潮霉素抗性基因共转化湘早籼33号和01早5202愈伤组织,经过抗性筛选和植株再生,得到了既含目的基因又含标记基因的共转化植株。研究结果如下: 1.籼稻成熟胚愈伤组织的诱导和再生体系的建立。三种水稻组织培养中常用的基本培养基(MS、N_6、CC)对愈伤组织诱导率影响不大,但以N_6培养基上生长的愈伤组织质量较好,而CC培养上培养的愈伤组织分化率较高。在实验中,选择以N_6培养基作为籼稻愈伤组织诱导的基本培养基,而以CC培养基作为愈伤组织分化的基本培养基。2,4-D是植物组织培养中最常用的愈伤组织诱导剂,但其浓度过高或过低都不利于水稻愈伤组织的诱导,在N_6基本培养基上添加1.5～2mg·L~(-1)的2,4-D能有效地诱导供试材料成熟胚愈伤组织的形成。适当浓度的6-BA(0.2～0.4mg·L~(-1))能改善愈伤组织的质量,提高其植株再生频率,但过高浓度的6-BA会对愈伤组织产生毒害作用。 2.细胞生长、分化和形态建成的方向取决于其生理和生化的变化。籼稻愈伤组织在继代培养过程中,可溶性蛋白含量呈现有规律的变化。在愈伤组织旺盛生长过程中,其可溶性蛋白含量明显提高,可溶性蛋白组分电泳条带增多。愈伤组织在转入分化培养基后,蛋白合成明显增加,可溶性蛋白含量分别在分化培养的第6d和第12d出现峰值,而此时正是愈伤组织形态发生明显变化的时期。这表明,蛋白质的活跃合成为器官的形态建成奠定了物质基础。愈伤组织培养过程中某些保护酶活性及其同工酶的变化反映了其细胞内自由基代谢的规律。PPO活性高低与愈伤组织褐化程度有关。POD和SOD活性的高低反映了细胞内代谢的旺盛