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石刁柏细胞培养及其L-天冬酰胺酶发酵

张永和  
【摘要】:本文以石刁柏品种UC800为材料,建立了石刁柏的细胞液体培养体系;对比了用不同的方法诱导多倍体效果;筛选出高产细胞系的培养方法,并对发酵液中的L-天冬酰胺酶的提取进行了初步探索。其主要结果概述如下: 1.建立了石刁柏的细胞液体培养体系: a.比较了酶解法和愈伤组织悬浮培养法获得单细胞的效果,同等条件下,愈伤组织悬浮培养法得到的细胞相对少,但形状圆而均一,活力和质量都比酶解法好。 b.通过对细胞液体培养条件的研究,确定了细胞培养条件为:MS+35 g/l蔗糖+4 mg/L NAA+0.5 mg/L6-BA、接种量为2.0×10~4个/ml细胞、转速为90r/min、pH为5.8、温度为28℃;在培养的第7-9d细胞活力最旺盛的时期;细胞团的形成培养基为MS+30g蔗糖+4mg/LNAA+0.5mg/LKT+0.5mg/L6-BA。 2.多倍体诱导的最佳效果: 在多倍体诱导时,同步化条件为4℃处理36 h,恢复培养12 h,在此处理条件下细胞的分裂指数最高,可达76%0;在此基础上固体混培法处理条件为:秋水仙碱0.05%、DMSO 4%,加倍率为20.8%。液体混培法处理条件为:秋水仙素0.05%、DMSO 4%,加倍率为22.9%。 3.石刁柏细胞中L-天冬酰胺酶发酵体系的建立 在石刁柏细胞培养的基础上,确定其最佳产酶条件为:培养基为MS+35g/L蔗糖+3 mg/LNAA+0.01 mg/L6-BA、pH值为6.4、温度为27℃、转速为110r/min、接种量为5.0×10~4个/ml。以此为基础筛选了石刁柏高产细胞系(Aspβ),分析了其产酶动力学:L-天冬酰胺酶发酵液酶活力的峰值可达到19.80 U/ml、产酶稳定期持续7~8 d。并依此,利用吴氏提取工艺得到回收率为30.8%,纯化倍数为9.85,比活力为0.55 U/mg的L-天冬酰胺酶。


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