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高羊茅离体培养再生体系的优化及农杆菌介导的遗传转化研究

唐小艳  
【摘要】: 病害是遏制当今草坪业健康发展的主要因素,高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)是一种优良的冷季型草坪草,由于它具有抗干旱、耐瘠薄、耐践踏、绿期长、适应性广等特点,在城市绿化和运动场地的建设中被广泛运用。但有些品种抗病性差,如对褐斑病和锈病等真菌病害较为敏感,严重制约了其草坪质量和景观。运用基因工程培育抗病品种能够解决传统育种中效率低、周期长的难题。溶菌酶具有几丁质酶和葡聚糖酶的双重活性,能分解细菌和真菌细胞壁组分多糖的β-1,4糖苷键,从而裂解病原菌来抵抗病菌的入侵。 本研究以目前广泛运用的猎狗五号(HuntdogⅤ)、交战二号(CrossfireⅡ)、德米尼(Deminion)、王朝(Dynasty)、新秀(Xinxiu)五个高羊茅新品种的成熟种子为试验材料,优化了其愈伤组织再生体系,初步建立了根癌农杆菌转化体系,为利用基因工程手段改良高羊茅品种奠定了基础。主要研究结果如下: 1.建立了高羊茅愈伤组织再生体系 (1)首次系统地比较了高羊茅六种外植体即成熟种子、去胚乳种子、去种皮种子、胚轴、幼根、幼叶对愈伤组织诱导和分化的影响。研究表明:不同外植体对愈伤组织的诱导和分化差异显著。诱导时以去胚乳种子为最佳外植体,其诱导率平均为76.5%远远高于其它外植体,种子切除胚乳后诱导率比完整种子提高了27.8%。而分化时胚轴愈伤组织分化率(86.25%)高于去胚乳种子(81.32%),但胚轴的剥离费时、费力。 (2)以各品种的去胚乳种子为外植体,研究了MS、改良MS(MSM)(MS无机盐+水解酪蛋白1mg/L+VB_19.9mg/L+VB_69.5 mg/L+尼克酸4.5mg/L)、CC、NB四种基本培养基对愈伤组织诱导、继代和分化的影响。结果表明:MSM是愈伤组织诱导的最佳基本培养基,诱导率达到80%~92.5%。但分化时却以MS为最佳,在MS+2.5 mg/L KT+2 mg/L6-BA上,五个品种分化率为66.8%~89.5%,其中以交战二号的分化率最高。 (3)本研究探讨了外源激素种类及浓度的配比对愈伤组织诱导和植株再生的影响。结果表明:高羊茅愈伤组织诱导需要较高的2,4-D浓度,多数品种以9 mg/L为最佳,添加0.5~1mg/L ABA对发芽和愈伤组织诱导有强烈抑制作用,出愈率最低为15%。继代培养基中降低2,4-D浓度同时添加0.02~0.1mg/L KT,能显著促进胚性愈伤组织的发生,两者最佳组合为5mg/L2,4-D+0.1mg/L KT。KT与6-BA配合使用对愈伤组织分化有增效作用,分化率最高达89.5%,最佳组合为2.5 mg/L KT+2 mg/L6-BA。 另外,试验发现,高羊茅不同品种之间愈伤组织诱导、继代和分化培养中存在明显差异,说明对品种进行选择是必要的。 2.进行了农杆菌介导的高羊茅转基因研究 本研究初步建立了以愈伤组织为转化受体的根癌农杆菌介导的遗传转化体系,首次将抗病原菌溶菌酶基因导入了高羊茅。研究结果表明:选择初次继代20d的胚性愈伤组织,用菌液浓度OD_(600)≈0.4的农杆菌浸染20~30min,共培养2~3d,以30~40 mg/L G418为筛选剂,连续筛选,遗传转化能得到较多转化植株且假阳性少。利用上述建立的遗传转化体系,本研究获得了猎狗五号、交战二号、德米尼三个品种共72株转菌溶菌酶基因拟转化植株,经PCR检测,其中有83.3%的个体为阳性。


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