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湖南家蚕微粒子病的病原体研究

廖模祥  
【摘要】: 本论文主要从湖南家蚕微粒子病病原体来源、病原性研究、超微结构、SSU-rDNA基因序列四个方面入手,试图探明危害我省蚕种生产的主要病原性微孢子虫的确切来源、生物学特征、致病机理以及该病原与高致病型家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,N.b)间差异,并为科学鉴别家蚕新型病原微孢子虫以及系统地防治家蚕微粒子病提供理论依据。本论文研究成果主要有: 1、研究证实我省微粒子病病原主要来源于桑园昆虫,其中最主要的病原为菜粉蝶微孢子虫(简称CFD)和桑尺蠖微孢子虫(简称SCH)。 通过对野外桑园昆虫的连续三年抽查检毒、桑叶浸洗消毒的对比实验,以及湖南省蚕种生产中发生的微孢子虫与各类昆虫微孢子虫在显微镜下的形态比较,证实湖南省蚕种生产上发生的微孢子虫与昆虫微孢子虫交叉感染极其相关。研究揭示出的昆虫微孢子虫发生率与蚕种毒率成正相关关系,为进一步防治家蚕微粒子病而进行动态监测和建立预警机制具有重要的借鉴作用。 2、对两种主要桑园害虫来源微孢子虫CFD和SCH及与家蚕高致病微孢子虫N.b展开了系统的病原性研究,结果证实该两种昆虫来源的微孢子虫对家蚕感染力非常强,且都具有弱胚传性。两者无论是原代孢子还是继代孢子感染家蚕后其病程都较长,病征不明显,发病极其缓慢,对饲养和制种成绩基本没有影响,因此与N.b存在显著差异,初步判断为异型孢子。 研究中还发现CFD、SCH能否成为胚种带毒种与患病母蛾体内的微孢子虫密度没有太大的相关性。 3、通过解剖感染CFD和SCH微孢子虫的家蚕各种组织,并进行显微镜镜检,发现在蚕的中肠、丝腺、马氏管、脂肪等组织中均能检出微孢子虫,说明该两种孢子虫可全面寄生于家蚕,与N.b一样属全身性寄生病原。 4、通过对CFD孢子虫的P、F1、F2做电镜扫描观察,发现其长短径比例及大小有变化趋势,并且随继代进行,孢子个体间形态及大小差异明显减少,群体趋于整齐一致,并向长短径比例缩小、孢子呈现饱满的方向发展,与N.b的形态差别逐渐减少。而SCH比较稳定,经家蚕继代后长短径体积有变小趋势且更接近于N.b。似乎说明家蚕的N.b最初来源于桑园昆虫。 5、用电镜透射扫描观察,CFD与SCH两者结构非常相似,孢子壁由三层组成,极体分为前后两部分,极丝同型,极丝切面为五层同心圆结构,核成对出现,核形不规则,核膜双层;粗面内质网附含大量的核糖体,孢子后部有后极泡,其周围可见液泡,超微结构这种特征均符合Nosema属的描述。因此,CFD和SCH微孢子虫均应为Nosema属。 6、通过设计不同的引物,对孢子虫的DNA模板进行了PCR扩增,获得核糖体小亚基RNA基因(SSU-rDNA)的部分基因序列并进行了分子生物学的鉴别与进化分析。结果发现菜粉蝶孢子虫(CFD)的SSU-rDNA基因部分序列片段的总长度为1128bp、桑尺蠖微孢子虫(SCH)SSU-rDNA基因部分序列片段的总长度为1133bp,两者与N.b在基因水平上都存在一定差异,表明两者都与N.b同属不同种。家蚕孢子虫(广东株)与两种昆虫来源的孢子虫在树型图上相距较远,而菜粉蝶和桑尺蠖相距较近,遗传距离为0.035;家蚕孢子虫(广东株)与桑尺蠖微孢子虫相比遗传距离为0.137,与菜粉蝶的遗传距离为0.101,说明如果家蚕N.b最初来源于桑园昆虫,在进化过程中也经过了长期的独立进化,形成了一个新的微孢子种。


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