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哈茨木霉(Trichoderma harzianum)发酵液中对豇豆具促生活性物质的研究

魏林  
【摘要】: 本论文研究主要分为两部分。 在第一部分中,着重研究了哈茨木霉T_(2-16)菌株的筛选方法和其高效发酵液的获得途径,以及该发酵液在豆科作物上的应用。主要内容有: 从不同生态区作物根际土壤中,利用诱捕法获得木霉菌株228株,从中筛选出一株对作物病原菌拮抗活性强、拮抗谱广、生长活力强的菌株,经鉴定为哈茨木霉(T. harzianum),编号为T_(2-16)。利用该菌株在筛选出的发酵培养基和培养条件下获得的发酵液,对长豇豆(Vigna sesquipedalisWight)进行防病试验,结果发现该发酵产物除对豇豆立枯病、枯萎病具有较好的防治作用外,对豇豆的生长也表现出明显的促进作用。田间应用表明,该发酵液对豇豆增产效果最高可达16.8%,并能提高豆荚的品质。此外,该发酵液在菜豆(Phaseolus vulgaris)、花生(Arachis hypogaea)、大豆(Glycine max(L.)Merr上应用也表现出较好的促生效果,其中对花生增产效果达21%左右(试验未在本研究论文中列出)。表明在该发酵液中存在具有对豆科作物生长具有较好促进作用的物质,这在国内外均未见报道。 针对哈茨木霉T_(2-16)发酵液对豆科作物具有显著促生作用这一现象,本论文以豇豆为材料,较系统地研究了哈茨木霉T_(2-16)发酵液不同浓度、不同使用方法对其不同的生长期(种子萌发、苗期生长、结荚期)的生理作用,以探明木霉发酵液在豆科作物不同生育期中所起的作用,挖掘出其在刺激植物生长及诱导植物抗性上的潜力,并为确定其使用适期和使用方法提供科学依据。 试验结果显示,该发酵液在促进豆科作物生长方面主要表现为: 1.提高种子发芽势提早种子的萌动,提高发芽势,促进胚根和胚轴的生长,使种子具有较高的活力指数 2.对豇豆苗期生长势有明显的促进作用哈茨木霉T_(2-16)发酵液浸种处理后,豇豆出苗早、幼苗粗壮;植株的叶绿素、蛋白质含量增加,叶色浓绿;幼苗长势旺盛,根系根瘤数、株高、鲜重及干重均有较大提高。这使豇豆生长有一个良好的开端,从而为提高植株抗逆性、增加产量打下了良好基础。 3.可诱导豇豆对立枯病和枯萎病的抗性用哈茨木霉T_(2-16)菌株发酵液在室内离体和温室盆栽活体植株条件下,进行了对豇豆两种重要病原菌-枯萎病菌(Fusarium oxysporum)和立枯病菌(Rhizoctonia solani)的拮抗性和拮抗机制研究。结果表明,该发酵液不但本身对两种病原菌具有抑制作用,还增加豇豆叶片中过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)等保护酶的活性,诱导豇豆对两种病害获得抗性,从而保证了植株的健康生长。该实验证明了哈茨木霉发酵产物也具有诱导作物抗病性这一防病机制。 4.可延长植株的生育期,提高产量和品质在豇豆苗期移栽时,用T_(2-16)发酵液进行蘸根处理。在豇豆结荚后期对植株主要生理生化指标测定显示:植株的主根长、根鲜质量、根冠鲜质量比、根体积和根系活力与清水对照和对照药剂(赤霉素)相比都有不同程度增加;T_(2-16)发酵液蘸根处理,还使豇豆后期功能叶片保持较高的叶绿素和蛋白质含量水平,植株体内具有较高的氮的积累量,使豇豆后期叶片仍维持较高的光合速率,延缓植株叶片衰老,有效地促进生殖生长,从而可提高产量。此外,蘸根处理后还可提高豆荚中维生素、蛋白质、可溶性糖等的含量,提高产品的品质。 在第二部分中,着重研究了哈茨木霉T_(2-16)菌株发酵液中对豆科作物具促生活性物质的分离、纯化及鉴定方法,以及该物质对豆科作物的促生作用。主要内容有: 通过树脂吸附、离子交换、薄层层析和高效液相色谱系统等分离纯化的方法,确定了一条有效的技术路线,获得了较为纯净的促生活性物质。通过多种官能团鉴定化学实验、TLC和HPLC等方法分析,表明该种对豆科作物生长具促进作用的活性物质为一种多肽类物质。并对该分离物的生物学性质作了初步研究。 利用HPLC获得了哈茨木霉T_(2-16)发酵液中的促生活性物质,以豇豆为研究对象,研究了该物质对豆科作物的促生作用,主要表现为: 1.可显著提高豇豆种子活力经哈茨木霉T_(2-16)发酵液中促生活性物质浸种处理后,影响了种子萌发过程重要生理生化过程,从而提高萌发种子的呼吸作用,增强超氧化歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性等保护酶活性,有效保护膜结构的完整性,减少了氨基酸、蛋白质、可溶性糖等胞内营养物质的外渗率,从而达到提高种子活力的目的。对处理的种子胚根进行组织切片观察发现,该物质还可促进豇豆根尖分生区生长点细胞提早和加快分裂,加快侧根和根毛的形成。 2.可提高豇豆结瘤和根瘤固氮能力,并增加豇豆根瘤中具固氮活性的中心组织(侵染组织)在根瘤中的比例经该物质浸种处理后,增加了根瘤菌对豇豆的识别与侵染力,使豇豆根瘤起始点数量、可见结瘤数、根瘤重量和固氮酶活性均不同程度高于对照。通过对处理与对照两种根瘤的显微及超微结构比较,发现处理后的根瘤中心组织受侵染细胞数增多,体积增大,细胞质丰富,细胞中类菌体数量也多于对照,液泡少而小。此外,处理后的根瘤中豆血红蛋白的含量也显著提高。表明T_(2-16)促生活性物质可通过影响豇豆根瘤的生长发育,进而影响其根瘤的固氮功能。 3.可改变豇豆根瘤菌的某些生物学特性,以利于豇豆提早结瘤,提早进入固氮期分别对从哈茨木霉促生活性物质浸种处理和清水对照处理的豇豆根瘤中分离的根瘤菌,进行生物学特性的比较研究。结果发现,分离自T_(2-16)处理过的豇豆根瘤菌与对照相比,具有较大的变化。主要表现为:根瘤菌代时缩短;对供试抗菌素的天然抗药性抗性增加,抗药谱加大,耐药浓度提高;耐酸碱的程度和对碳、氮源利用范围两种菌株虽然差异不大,但处理菌的生长势优于对照菌。表明T_(2-16)发酵产物浸种处理后,能加快根瘤菌的分裂,增强根瘤菌的生长速率,提高对环境的某些抗逆性,从而提高豇豆根瘤的大小和固氮活性,提高植株对氮素的利用率。EST同工酶电泳结果也证明,经该物质处理后,豇豆根瘤菌的遗传性状较原始出发菌株和对照菌株发生了改变。 本论文中关于木霉发酵产物对蔬菜土传病害的诱抗作用;木霉发酵液中对豆科作物具促生活性的肽类物质分离及纯化;木霉促生活性物质对豆科作物结瘤、根瘤结构、类菌体超微结构、根瘤菌生物学特性、豆血红蛋白含量的影响均未见研究报道,本论文为首次较系统的研究报道。


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