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猪ETEC F4受体相关基因及其相关SNP筛选的研究

蒋隽  
【摘要】: 本实验首先采用体外黏附表型检测方法检测了大约克和沙子岭初生仔猪F4三种血清型的黏附型,以期发现其遗传差异性。并从小肠上皮细胞提取总RNA用于下一步的试验,即采用δ差异显示方法寻找与ETEC F4黏附表型相关的基因。并通过筛选与受体相关的SNP,进一步研究相关基因与受体的关系。 主要研究结果如下: 1.体外黏附测定结果表明,F4 ab黏附素对大约克猪和沙子岭猪均黏附强烈,而F4ac则表现为不黏附。二个品种中均存在较高频率的F4abR~+-acR~-。ad黏附素对沙子岭猪的黏附较强烈(0.400),而对大约克猪并不强烈黏附(0.242)。上述结果也暗示猪F4 ab受体和ac受体存在较强的连锁而与ad受体并无此关系。 2.本实验采用在δ差异显示法共检测到67条差异片段。在F4 ab黏附差异带检测中,检测到22条差异条带,其中有13条在黏附型样品中特异表达,9条在不黏附型样品中特异表达。在F4 ac黏附差异带检测中,共检测到21条差异条带,其中有13条在黏附型中特异表达,8条在不黏附型样品中特异表达。在F4 ad黏附差异带检测中,共检测到24条差异条带,其中有13条在黏附型中特异表达,11条在不黏附型样品中特异表达。 3.67条δ差异片段的再扩增PCR中,有7条差异片段没能实现特异性扩增,没作进一步分析。在60个再扩增差异片段中,,Northern blot结果表明有7个差异片段表现为假阳性。找到了53个阳性差异片段,阳性率为88.3%(53/66)。 4.克隆载体送测序公司测序后,到NCBI网站进行BLAST比对,本试验共测序了30条片断,其中比对结果有高同源性(>85%)且同源的长度大于60个碱基的片断有7条,有同源性但低于85%或同源的长度较短的片断有12条,其余11条为新基因片断。 本试验将其中20条EST登录到GenBank中,登录号分别为DQ217772,EC268686,DW286736-2867939,EB739624-739627,和EE392468-392477。 BLAST结果表明,F4 ab黏附差异带13,与agouti signaling protein(ASIP)有90%(111/123)的同源性;,F4 ac黏附差异带3,与人ATPase,Ca++ transporting,plasma membrane 1(PMCA 1),有91%(239/260)的同源性。F4 ad黏附差异带9,与glycosylinositolphohatidyl anchor 1(GPI 1)有91%(216/237)的同源性。综合同源比对的结果和对基因功能的了解,选择了ASIP、PMCA 1和GPI 1基因分别为F4ab,ac和ad受体的相关基因,但并不排除其它基因也对于受体的表达有着一定影响。 5.对于三个基因,分别设计了4对引物,筛选与受体相关的SNP。结果表明: 5.1对于ASIP基因,结果经同源比对后发现,其中由引物1扩增产物在485碱基处,所有黏附型个体的碱基均为G,而所有不黏附型个体的碱基均为A,在第619碱基处,所有黏附型个体的碱基均为A,而所有不黏附型个体的碱基均为T。可见这二个位点的SNP很可能是影响黏附性,也就是影响F4ab受体有无的位点。 5.2对于PMCA 1基因,测序结果经同源比对后发现,其中由引物2扩增产物在142碱基处,所有黏附型个体的碱基均为A,而所有不黏附型个体的碱基均为T。可见这个位点的SNP很可能是影响黏附性,也就是影响F4ac受体有无的位点。 5.3对于GPI 1基因,结果表明,引物2扩增产物在第242、243碱基位置,所有F4 ad黏附型个体均为AT,而所有不黏附型个体均为TG。可见这个位点的SNP很可能是影响黏附性,也就是影响F4 ad受体有无的位点。 5.4而在这3个基因其它位置,虽然发现一些SNP,但这些SNP都与黏附性没有明显的相关性。因此不予考虑。


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