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地肤子皂苷及抗过敏作用的研究

刘建萍  
【摘要】: 地肤子为藜科植物地肤Kochia Scoparia(L.)Schrad.的干燥成熟果实,为我国传统中草药。据药理学研究,地肤子水提取物有抑制单核-巨噬系统的吞噬功能及迟发型超敏反应(DTH)。70%醇提物对速发型及迟发型变态反应有抑制作用。学者对地肤子化学成分的研究中分离出了多种三萜皂苷及皂苷元,但是化学成分与生物活性相结合的研究报道不多,对于地肤子皂苷的构效关系不是很清楚。而构效关系的信息,对从自然界中寻找抗变态反应先导化合物(leadcompounds)和进行结构改造或修饰,以及对创制新药都具有重要意义。因此,本项课题针对目前地肤子研究中有待解决的几个问题,采用活性跟踪法探明地肤子皂苷硅胶柱层析的活性部位,并对活性部位进行分离、纯化,以期得到高纯度的具有生物活性的皂苷类化合物单体,利用波谱技术确定其结构,进而检测各种单体的抗变态反应活性,通过分析单体化合物结构与其抗变态反应活性大小的关系,获得地肤子皂苷构效关系的信息;对地肤子皂苷进行进一步的抗过敏实验,对地肤子的药用价值和药理机制获得更加充分的认识;对大孔吸附树脂富集、纯化地肤子总皂苷的有关参数进行初步研究,旨在获得一种无有机溶剂残留,成本低,洗脱率、得率和精制度较高的工艺,为地肤子总皂苷的工业化生产提供技术支撑;本论文为更加有效地开发地肽子这一天然植物资源提供坚实的应用理论基础,为研制高效,副作用小的抗变态反应天然药物提供科学依据。试验研究结果归纳如下: 1.地肤子皂苷活性部位的筛选 把柱层析与活性跟踪法相结合,采用小鼠过敏性皮肤瘙痒模型,对地肤子总皂苷硅胶柱层析的不同部位进行抗变态反应能力检测,以筛选出活性部位。首次明确了地肤子皂苷硅胶柱层析,氯仿-甲醇梯度洗脱的活性段,即:氯仿-甲醇9:1第2BV→6:4梯度段是地肤子皂苷的活性部位,抗变态反应活性成分主要集中在:氯仿-甲醇为9:1的第2、3柱床(BV),8:2的1~3BV,7:3的1~3BV洗脱液中。这对于地肤子抗变态反应有效成分的深入研究和新型抗变态反应药物开发具有重要的参考价值。 2.活性成分的分离及其结构鉴定 本研究采用经典的柱层析法将地肤子粗皂苷上硅胶柱(6×90cm,200-300目)进行柱层析,按照活性部位筛选试验结果,用9:1→6:4的氯仿-甲醇(活性部位)进行梯度洗脱,以极性不同的展开剂进行薄层层析(TLC)为检测手段,合并相同流份后再经硅胶柱层析,对地肤子皂苷活性部位的化学成分进行了分离纯化,以期得到含量较高的单体化合物。结果:分别从部位4、5、6(氯仿-甲醇8:2的第1BV、2BV、3BV)得到化合物Ⅰ;分别从部位3、4(氯仿-甲醇9:1的第3BV、8:2的第1BV)得到化合物Ⅱ、从部位2、3(氯仿-甲醇9:1的第2BV、3BV)得到化合物Ⅲ。通过理化反应、TLC及IR、~1H-NMR、~(13)C-NMR光谱分析手段鉴定了这3个化合物,化合物Ⅰ为齐墩果酸3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷(3-O-β-D-Xylopyranoyl(1→3)-β-D-glucuronopyranosyl Oleanolic acid,Ⅰ)、化合物Ⅱ为齐墩果酸3-0-β-D-吡喃木糖(1→3)β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯苷(3-O-β-D-Xylopyranoyl(1→3)-[6-O-Methyl-glucuronopyranosyl]Oleanolic acid,Ⅱ)、化合物Ⅲ为齐墩果酸(oleanolic acid,Ⅲ)。 3.地肤子总皂苷及其单体化合物抗变态反应作用的研究 首次以地肤子总皂苷为材料,通过小鼠过敏性皮肽瘙痒模型和组胺致小鼠足肿胀试验,进一步研究地肤子皂苷抗变态反应的药理作用,并对地肤子总皂苷的剂量药效关系进行探索,结果,地肤子总皂苷具有抵抗4-氨基吡啶(4-AP)所致过敏性皮肤瘙痒作用和抵抗组胺所致小鼠足肿胀,说明总皂苷为其抑制速发型变态反应的有效成分,其作用机制可能与稳定肥大细胞膜,减少组胺的释放及对抗过敏介质的致炎作用有关。地肤子总皂苷的抗变态反应作用具有量效关系,32mg/kg为其有效阀剂量,150mg/kg为其良效剂量。 以分离得到的单体化合物为材料,通过4-AP致过敏性皮肤瘙痒模型,研究其抗变态反应作用大小,再比较它们的结构特点,探究其构效关系,结果显示皂苷元齐墩果酸具有一定的抗过敏作用,但与其皂苷齐墩果酸3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷相比,抗过敏能力弱得多,齐墩果酸3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯苷未表现出抗过敏作用。说明齐墩果酸的第3碳原子连接的二糖中β-D-吡喃葡萄糖醛酸的羧基是重要的官能团,甲酯化后其抗过敏活性消失。提示修饰此官能团可能会引起抗过敏作用的较大改变。首次得到的这一结论,为未来合成、研制新型抗变态反应药物提供了参考。 4.大孔树脂纯化地肤子总皂苷工艺的研究 首次把大孔树脂柱色谱法用在地肤子总皂苷的纯化上。通过5种树脂对地肤子皂苷的静态吸附和解吸试验,选取了D-101-Ⅰ来富集、纯化地肤子总皂苷。研究表明,D-101-Ⅰ树脂富集、纯化地肤子皂苷的最优条件为:上样量为2.238g生药/ml,先用3BV蒸馏水洗去杂质,然后以3BV的50%乙醇溶液洗脱。通过大孔树脂富集与纯化后,地肤子总皂苷洗脱率为90.56%,总皂苷得率为42.89%,总皂苷精制度高达263.59%。


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