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抗旱高羊茅品种FapDREB2基因克隆和WAX2基因的遗传转化

张志飞  
【摘要】: 城市草坪在构建优美清洁的现代化城市方面担当着重要角色,在城市生态系统的物质能量循环及转化过程中起着重要作用。高羊茅(Festuca arundinaceum var.genuina Schreb.)是冷季型优良草坪草种,广泛用于运动场草坪、园林绿化、生物护坡等,在环境绿化与生态保护方面发挥重要作用,是我国目前使用量增长最快的草种。但高羊茅的夏季生长需水量较大,夏季干旱和高温环境条件已成为限制其生长的主要因素。提高环境的适应性是目前高羊茅育种的主要目标之一。植物抗逆性状非常复杂,往往与数量性状位点连锁,而高羊茅的遗传背景复杂,基因组较大,采用传统的育种方法获得优良抗性品种十分困难,基因工程技术为高羊茅抗性育种提供了便捷之径。本论文从高羊茅抗旱性相关基因克隆和农杆菌介导转化两方面着手,希望可以在高羊茅抗性机理和基因工程育种方面开展一些有意义的工作。本论文主要研究内容如下: 1.明确了叶片表皮蜡质含量与高羊茅抗旱性的关系 对14个经受高温干旱胁迫的高羊茅品种进行综合抗旱性分析发现:在干热胁迫下,高羊茅品种叶片表皮蜡质含量与水分利用效率存在显著正相关,高羊茅叶片气孔附近的蜡质成分对气孔导度和胞间CO_2浓度有着显著影响,在干热胁迫时,高羊茅蜡质含量可以通过对气孔导度的调节来减少气孔蒸腾,提高水分利用效率。逆境胁迫下蜡质的积累在减少表皮蒸发的同时,对气孔蒸腾也有重要影响。高羊茅品种的表皮蜡质含量与抗旱性有密切相关性,因此建议今后将表皮蜡质含量列为高羊茅抗旱性品种鉴定的新指标。综合抗旱性较好且蜡质含量较高的品种有:‘家园'(Plantation)和‘交战Ⅱ'(CrossfireⅡ)。 2.克隆得到了高羊茅FapDREB2-cDNA 以干热胁迫下抗旱性最好的高羊茅品种‘家园'为材料,利用Touchdown~(TM)PCR成功分离了FapDREB2的cDNA序列,该序列长799bp,包括一个连续的ORF,编码262个氨基酸,含有DNA特异结合的AP2结构域,基于序列同源性分析和系统进化树分析发现,该基因属于DREB2基因家族。 组织特异性分析发现,FapDREB2基因在高羊茅叶片、叶鞘表达较强,而在其根中表达较弱。FapDREB2基因在干旱和高温条件下的表达明显强于没有任何处理的对照。表达模式分析发现,FapDREB2基因的转录水平受干旱和高盐胁迫的强烈诱导,受低温胁迫的微弱诱导,而ABA对其不起作用,表明FapDREB2通过不依赖ABA信号传导途径,参与干旱、高盐胁迫诱导反应。FapDREB2基因受干旱和高温环境胁迫诱导时,其转录水平呈现不规则的变化,说明FapDREB2基因对干旱和高温环境胁迫的反应是复杂的。 3.建立了高羊茅种子内生真菌消毒方法 以不同温度(40℃,50℃,60℃)、不同时问(10 min,20 min,30 min)的温水浸泡和次氯酸钠配合使用处理高羊茅种子,并进行发芽率试验和愈伤组织培养,结果显示,适用于富含内生真菌的高羊茅种子的最佳消毒组合为50℃温水浸泡10min,再经70%酒精处理5 min,然后用次氯酸钠处理15 min。本消毒方法在保证较高种子发芽力的前提下,降低种子污染率,提高出愈率。 4.分析了7个高羊茅品种出愈率和分化率的基因型差异 对过渡地带常用的7个高羊茅品种的愈伤组织诱导和植株再生研究发现,高羊茅的愈伤组织出愈率和分化率之间没有等级相关性,基因型的差异对高羊茅出愈率和分化率有重要影响。出愈率和分化率都较好的高羊茅品种是‘爱瑞Ⅲ'(AridⅢ)。 5.初步构建了农杆菌介导高羊茅转WAX2基因的遗传转化体系 以‘家园'、‘交战Ⅱ'和‘爱瑞Ⅲ'作为WAX2基因的高羊茅愈伤组织的遗传转化受体材料,利用EHA105和LBA4404两个农杆菌菌株进行农杆菌介导转基因研究,获得了7个转WAX2基因的阳性植株。遗传转化研究发现,EHA105菌株与pCAMBIA-1300-multi质粒配合使用的遗传转化效率高于LBA4404菌株与pCAMBIA-1300-multi质粒配合,获得抗性再生植株数较多,转基因阴性植株较少。确定在EHA105菌株与pCAMBIA-1300-multi质粒配合的遗传转化体系中,高羊茅转化愈伤组织的潮霉素筛选浓度约为150 mg·L~(-1)。 本研究首次分析了高羊茅表皮蜡质含量与抗旱性的关系,并确定蜡质含量可列为高羊茅抗旱性品种鉴定的新指标,这为利用生物技术手段提高高羊茅品种的蜡质含量,改良高羊茅品种的抗旱性提供了重要理论依据。以14个高羊茅品种的抗旱性分析为基础,一方面从高温干旱环境胁迫下抗旱性较强的‘家园'中成功克隆出FapDREB2基因cDNA,这将为改良高羊茅或其它资源植物的抗逆性提供优良的基因资源。另一方面,综合高羊茅品种抗旱性和愈伤组织出愈率、分化率,选取‘爱瑞Ⅲ'、‘家园'和‘交战Ⅱ'作为转化受体材料,首次将蜡质相关基因WAX2导入3个高羊茅品种中,并从基因型、外植体材料的湿热消毒方法、农杆菌菌株、潮霉素抗性筛选浓度等方面进行了探讨,为高羊茅的抗旱基因工程育种与遗传改良奠定了基础,将有助于抗逆性(抗旱、耐热)优良高羊茅品种的培育。本研究工作对于推动我国草坪业的发展、保护生态环境、美化人类生存空间等具有重要意义。


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