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柑橘低温诱导相关基因的克隆与表达分析

龙桂友  
【摘要】: 柑橘原产我国,目前我国是第二大柑橘生产国。冻害是世界性的柑橘生产上的主要灾害之一。历史上,我国长江流域、美国佛罗里达州和加里佛利亚州等柑橘产区就因严重的周期性冻害数次遭受严重打击。抗寒育种成为世界各柑橘生产国柑橘育种的主要内容之一。人们通过各种传统的育种手段去改善柑橘的抗寒性,由于柑橘的抗寒性是多基因控制的数量性状,抗寒力强的通常为野生类型,其杂种后代果实味苦不能食用,再加上多胚性的干扰,使得柑橘的抗寒杂交育种一直未取得重大突破。基因工程技术给柑橘抗育种带来了希望。在中国,枳(Poncirus trifoliata(L.)Raf.)是商业栽培柑橘品种的一种主要砧木,因为枳作砧木可提高嫁接品种的抗寒能力及对某些病虫的抗性。因而,与不太抗寒的柑橘相比,枳很有可能拥有并表达特别的低温响应基因或蛋白质以增强其抗寒性,然而对这类基因或蛋白质知之甚少。本研究采用抑制性差减杂交技术和蛋白质组技术,以柑橘枳为主要材料,从转录水平和翻译水平分离柑橘低温诱导差异表达的相关基因,为实施柑橘抗寒基因工程培育抗寒品种奠定基础,为探明柑橘抗寒的分子机理提供理论依据。取得研究结果如下: 摸索出2年生枳苗和宫本苗在生长期秋季耐受低温的临界处理分别为-6℃处理60min和-6℃处理40min,为后续试验的材料处理奠定了基础。 完善了抑制性差减杂交试剂盒(PCR-Select~(TM)cDNA Subtraction Kit)在柑橘植物上的应用,用看家基因ACTIN基因(上游引物5'-CACACTGGAGTGATGGTTGG-3',下游引物5'-ATTGGCCTTGGGGTTAAGAG-3')检测接头连接效率和差减杂交效率,接头连接时间延长至20h。 从柑橘枳叶片中克隆到1个长849bp的冷诱导基因Ptcor8,生物信息学分析结果显示,Ptcor8属于植物WCOR413冷诱导蛋白家族的一个cDNA全长,具有一个621bp的潜在编码区,编码206个氨基酸残基的蛋白质。功能预测结果显示,Ptcor8编码的蛋白质分子量为22.8kD,pI9.4,具有5个疏水区,5个跨膜螺旋,6个丝氨酸磷酸化位点,亚细胞定位和分子系统发育分析均表明该蛋白为质膜型冷诱导蛋白。Ptcor8基因已提交GenBank,接受号为EU077497。对Ptcor8基因进行了初步的表达分析,该基因在26℃时不表达,在17℃~-6℃时表达,持续表达时间不短于1d,与枳低温诱导的抗寒锻炼关系密切。 用双向电泳技术获得枳和宫本低温诱导的差异蛋白质表达谱,在质谱分析的22个差异表达蛋白质点中,4个蛋白质点的鉴定结果可信度较高。选择可信度较高的枳2号蛋白质点鉴定结果抗性蛋白(resistance protein)设计简并引物,以枳基因组DNA为模板扩增,扩增产物回收纯化、克隆测序,得到1个长676bp的抗性蛋白编码基因Ptcorp,BLAST同源搜索结果显示,Ptcorp与越橘蓝丰低温锻炼表达文库中的一个EST具有88%的同源性,预示Ptcorp与低温锻炼有关。半定量RT-PCR表达分析结果显示,低温胁迫时Ptcorp明显上调表达,与蛋白质水平上的研究结果一致。


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