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放线菌HNS2-2的分离、鉴定及抗烟草花叶病毒活性产物的研究

陈力力  
【摘要】: 植物病毒病是农业生产中发生普遍、危害严重的一类病害,每年给农业生产带来很大的经济损失。现有的化学药物对植物病毒病的防治效果不佳,且对生态环境、人畜生存质量有负面影响。植物源农药因植物资源有限、成本高、效果不稳定等因素,难以商品化生产。因此,筛选、开发微生物源抗植物病毒活性物质是防治植物病毒的主要研究方向。 放线菌(Actinomycetes)是与人类关系极为密切的一类微生物,它们广泛存在于不同自然生态环境中,可以产生多种抗生素及非抗生素类活性产物,应用于人类细菌病、真菌病、寄生虫病、肿瘤甚至病毒病的防治。放线菌中以链霉菌合成抗生素次生代谢产物的能力最强,放线菌产生的抗生素中有90%是以链霉菌作为生产菌种生产的。现已从链霉菌中得到土霉素、金霉素、氯霉素、红霉素等氨基糖苷类、大环内酯类、多烯类、聚醚类抗生素。但对于防治植物病害的抗生素,尤其是抗植物病毒的活性物质,却很少报道。 本文从土壤放线菌的分离、抗TMV菌株的筛选、菌株的鉴定、摇瓶发酵条件的优化以及活性物质追踪分析等方面进行了系统研究,结果如下: 1)为了提高土壤中放线菌的分离效率,解决放线菌分离培养中真菌、细菌污染问题,采用多种分离培养基和不同浓度抑制剂,从土壤样品中选择性分离放线菌,试验结果表明,土样于90℃条件下加热处理1h,在10倍稀释的土壤悬浮液中,加入0.05%SDS,于40℃振荡20min后,用稀释平板涂布法接种于含有重铬酸钾(质量浓度为100mg/L)高氏1号培养基平板上,28℃培养6、7d,生长的放线菌数量多,且细菌、真菌数量少,最适于放线菌分离。采用此种方法从117份土样中分离得到放线菌菌株413个。 2)采用摩擦接种法接种烟草花叶病毒(TMV)系统侵染寄主普通烟草K326、枯斑寄主曼陀罗,反复筛选,得到具有抗TMV活性的放线菌菌株HNS2-2。 3)通过对HNS2-2菌株进行培养性状、形态特征、生理生化特征、16S rDNA序列的测定及其系统发育分析的研究,表明HNS2-2为一种链霉菌,与草绿色链霉菌的模式菌株S.herbaricolor strain NRRL B-3299T的序列同源性为100%,因此归入草绿色链霉菌,16S rDNA序列已在GenBank注册,登录序列号为EU035296。 4)进行摇瓶发酵培养基筛选、发酵温度、初始pH、接种量、装液量、种龄、发酵时间等条件优化,得出发酵培养基为10%大米粉、2.2%黄豆粉为主要成分,最佳发酵条件为取种龄24h按接种量8%接种,在初始pH7.2-7.4、30℃、220r/min条件下进行摇瓶发酵培养。 5)在对新菌株HNS2-2抗病毒活性物质的研究中,通过对发酵液进行加热酸化预处理、蒸发浓缩、透析分离、乙酸乙酯萃取逐级分离和活性追踪分析,得知HNS2-2活性物质为小分子脂溶性复合物。


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