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脂肪酶产生菌的筛选及固定化脂肪酶在生产生物柴油中的应用研究

张振乾  
【摘要】: 生物柴油是由大豆油、菜油等植物油或动物脂肪通过低碳醇在催化剂作用下形成的长链脂肪酸单酯类物质,具有不受地理、环境等因素的影响,可减少对石油市场的依赖等优点而受到越来越多的关注。 原料的价格、供应和廉价的脂肪酶是影响酶法生产生物柴油的关键因素。为解决这些问题,在本研究中,筛选了25株脂肪酶产生菌并对其中效果较好的2个脂肪酶进行催化生产生物柴油的研究,同时研究了原料的影响,为筛选合适的原料提供了参考。 研究内容和结果如下: 1.筛选得到25株脂肪酶菌种,其中8株活性较高,对其中活性较好的3株进行,并种类鉴定、最佳培养条件确定等研究。 产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)以1.0%的葡萄糖和1.5%的NaHCO_3为C源,1.5%的蛋白胨为N源,添加0.1%MgSO_4.7 H_2O,起始pH 9.0,装液量50mL/100 mL,120 rpm,30℃培养48 h,酶活达34.16 U/mL;加入1.0%的橄榄油,酶活可提高到66.31 U/mL。该脂肪酶在30℃,pH 8.0时酶催化活性较高。 成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)以2%的乳糖作为碳源,1.5%的牛肉浸膏和1.0%的酵母膏作为氮源,添加0.1%MgSO_4·7 H_2O,初始pH 7.0,120 r/min,30℃培养48 h时产酶活力达39.09 U/mL。发酵液在30℃,180 r/min时催化性能较强。在反应体系中含水量达91%以上时,仍可催化芝麻油生产生物柴油,产率达54.51%。 乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus),以1.5%的麦芽糖作为碳源,2.5%的NH_4Cl为氮源,初始pH 7.0,接种量1.0%,装液量40 mL/100 mL,120 r/min下30℃培养24 h,酶活达9.07 U/mL。2.确定了气相色谱内标法测定生物柴油方法 以十七酸甲酯为内标,依据菜籽油组分含量不同,改进了气相色谱内标法测定生物柴油方法,建立了棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯和花生一烯酸甲酯的线性方程,使各个组分同时处于测量范围内,确保了测定结果的准确性。各脂肪酸甲酯含量在各自线性范围内的相关系数r≥0.999、平均回收率在97.91%-100.45%,精密度高,试验标准偏差在0.28%-2.22%,重复性好。该体系可用于菜籽油合成生物柴油产率测定,也可用于原料成分影响研究和原料的筛选研究。 3.脂肪酶固定化的研究 对产气肠杆菌和成团肠杆菌发酵液得到的沉淀进行冷冻干燥,采用硅藻土固定化。 产气肠杆菌:硅藻土用量与酶粉用量为10:1,20℃下吸附2 h,得到的固定化酶的活性最大(1111.1 U/g)。该固定化酶在30℃,pH 8.0条件下催化性和稳定性较好。 成团肠杆菌:硅藻土用量与酶粉用量为15.625:1,15℃吸附1.5 h,得到的固定化酶的活性最大(666.7 U/g)。该固定化酶在30℃,pH 8.0条件下催化性和稳定性较好。 4.有机溶剂体下催化生产生物柴油 硅藻土固定化产气肠杆菌脂肪酶用量为1000 U,乙醇为酰基受体(醇:油摩尔比为4:1,2次等量加入),5 mL正己烷,180 r/min,35℃,反应48 h,转化率达92.91%。同时还发现,水对该反应有抑制作用,随着其含量增加,转化率降低;油酸对该反应有促进作用,而芥酸有不利影响。 硅藻土固定化成团肠杆菌脂肪酶用量为1000 U,甲醇为酰基受体,甲醇与油摩尔比为3:1,3次等量加入,5 mL正己烷,180 r/min,35℃反应48 h,转化率到91%。该反应体系可用于催化大豆油和葵花子油生产生物柴油,产率分别为88.57%和83.51%。该体系也可催化含水原料生物柴油,在反应体系中水含量达25%时,仍可获得61.97%的转化率。 该研究取得了如下创新: (1)筛选得到3株活性较高的脂肪酶产生菌,进行了分类鉴定和培养条件优化: (2)改进了气相色谱内标法测定生物柴油方法,纠正了前人该方面研究的不足; (3)在有机溶剂体系下催化生产生物柴油的研究,并得到较高的产率,证实本研究得到脂肪酶的有效性,也为原料筛选提供了参考。


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