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诱导超敏反应增强辣椒广谱抗病性的转基因研究

黄真池  
【摘要】: 青枯菌(Ralstonia solanacearum)是引起包括辣椒在内的多种重要作物青枯病的病原细菌。青枯菌通过T3S(Ⅲ型分泌系统)、T2S(Ⅱ型分泌系统)等将多种毒性因子输送到胞外使植物致病。转基因抗病、培育抗性品种和生物防治是防治青枯病的主要途径。转基因抗病中,常存在转基因作物抗性范围过窄、抗性不稳定、发育异常、产量下降等不足。使用诱导型启动子来调控广谱抗性基因表达,通过诱发超敏反应提高植物抗病性是理想的基因工程策略。 遗传转化体系的建立是作物抗病基因工程的前提。保加利亚尖椒12d龄子叶在MB+29.41μmol/L AgNO_3+15.54-22.20μmol/L 6-BA+2.85-5.71μmol/L IAA+75-100μmol/L Spd+1.14μmol/L ABA+5.0 mL/L PSJ,87.64 mmol/L蔗糖,pH 5.8的培养基中培养容易得到高质量的不定芽。辣椒幼苗汁液对不定芽的诱导分化及伸长有明显的促进作用,添加脱落酸和亚精胺可促进不定芽伸长。本再生体系中,不定芽诱导率达100%,不定芽伸长率达83%,生根率达到100%。将农杆菌侵染后的子叶置于暗处共培养4d,直接转移到含Kam100 mg/L、Cef 500 mg/L的选择分化培养基,并连续照光1周,转化植株阳性率达75%。 按GenBank中受病原物诱导的植物启动子(pathogen-inducible plant promoters,PPPs)的碱基序列设计3对引物,从烟草基因组中扩增到3个启动子,PPP1、PPP2和PPP3。用PPPs替换pBI121中与gus基因相连的35S启动子,再将重组质粒导入农杆菌GV3101,构建了PPPs和gus相连的转化单元。通过农杆菌介导法将受PPPs控制的gus基因导入辣椒。转基因辣椒叶片接种青枯茵24h后,检测到GUS活性显著上升。表明转基因辣椒中PPPs能受青枯菌的诱导。 将PPP3和pUC 19连接后转化E.coli DH5a,通过蓝白筛选和PCR检测筛选阳性菌落。双酶切PPP3和含目的基因(pflp或hrap)的pBI121质粒,分别回收PPP3片段和含目的基因的pBI121大片段,连接后转化E.coli DH5α,通过卡那霉素抗性筛选和PCR检测,筛选PPP3和目的基因正确连接的重组质粒。从重组质粒扩增出PPP3+pflp+nos片段,酶切后插入到PPP3+hrap+nos片段前的HindⅢ位点,再将重组质粒转化农杆菌GV3101,PCR检测可扩增到pflp+nos+PPP3+hrap片段,表明两价诱导表达载体构建成功。 经农杆菌介导法用两价诱导表达载体转化辣椒,得到了转基因植株。经PCR和Southern blotting证明pflp和hrap基因成功插入到辣椒基因组并能遗传给子一代。RT-PCR结果显示,在PPP3的控制下pflp和hrap有一定的本底表达量。以actin作内参基因,实时荧光定量PCR分析转基因植株子一代接种青枯菌前后目的基因表达量的变化,发现接种后pflp基因转录效率提高到原来的13.08倍,hrap基因转录效率提高到原来的9.93倍。说明受青枯菌诱导后,PPP3控制的pflp基因和hrap基因转录效率显著升高。 灌根接种青枯菌,转基因植株无明显致病表现。转基因辣椒叶片接种青枯菌后,接种部位表现出明显的超敏反应。转基因辣椒受青枯菌诱导后,H_2O_2含量的增幅为27.4%,SOD活性增幅为55.2%,PPO活性增幅为66.0%,CAT活性降低了21.3%,MDA含量降幅为9.2%。灌根接种疫霉菌孢子,转基因植株表现出发病延迟、病情进展缓慢等抗病特点。说明受青枯菌诱导时PPP3启动pflp和hrap高效表达,并通过引发超敏反应增强了辣椒对青枯病和疫病的抗性。 与非转基因植株相比,转基因辣椒叶绿素含量降低了15.6%,不同转基因植株间光合速率相差较大,分别为对照的84.9%、93.4%、99.6%,但都小于对照植株。从表型看,转基因植株生长缓慢、株高变矮、叶面积变小、开花延迟,说明外源基因的插入及表达对辣椒的生长发育有一定的不良影响。


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