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pthA-nls及其ScFv基因转化柑橘获得抗溃疡病新种质的研究

胡春华  
【摘要】: 柑橘溃疡病(citrus bacterial canker disease)是由地毯黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.citri)引起的一种世界性检疫性病害,对柑橘产量及品质影响极大,严重危害着柑橘产业的健康发展。然而,到目前为止,尚无一种能根除柑橘溃疡病菌的最佳方法,柑橘品种资源中亦未发现完全抗病的品种,长期的常规育种,也没有获得抗柑橘溃疡病的优良杂种,柑橘抗溃疡病育种没有取得实质性进展。病原基因pthA是柑橘溃疡病亚洲型(A型)致病所必需的因子,其中3个核定位信号区是PthA的重要功能区,在寄主细胞内起识别定位的作用。本研究以柑橘溃疡病致病基因pthA为出发点,利用病原基因诱导植物获得抗性原理,将致病基因pthA的核定位信号NLSs构建正义和反义基因,导入柑橘感病品种甜橙中,使其过量表达失去原有功能的蛋白,或表达蛋白失去原有的时空性,或表达蛋白激活植物本身的防御系统,从而干扰病原菌的正常的生理代谢;另一方面,利用单克隆抗体和植物抗体技术,制备抗致病因子PthA核定位信号肽NLS单克隆抗体,分离出抗体基因的轻链和重链,并构建单链抗体基因ScFv,将其导入柑橘感病品种,通过在柑橘体内表达抗体蛋白,结合致病因子PthA蛋白的功能位点,阻断致病蛋白向细胞核的运输途径,从而达到抗病的目的。通过对转基因甜橙的抗性筛选和外源基因的表达分析,对进一步研究柑橘溃疡病的致病机理具有重要的理论意义。同时,选择高感病的主栽品种甜橙进行试验,获得的抗病新种质,从根本上控制柑橘溃疡病的危害,对柑橘产业意义重大。本研究取得研究结果如下: 1、从湖南省各柑橘产区感病果园分离纯化柑橘溃疡病菌株50份,并根据致病基因pthA和柑橘溃疡病菌独有的保守蛋白基因差异序列,设计筛选出特异性引物对,通过优化PCR反应条件,利用PCR技术从质粒和基因组两方面对柑橘溃疡病进行鉴定,并利用离体接种对获得的菌样作最终鉴定,为后续试验提供了试验材料。 2、利用long-PCR和net-PCR方法,得到pthA完整的编码区并将其克隆到植物表达载体pBI121中。序列分析结果表明,克隆得到的pthA′与Genbank中的pthA(U28802)序列有99.8%的同源性。pthA′基因的克隆为进一步研究其功能奠定了基础。 3、构建了pthA-nls正义基因和pthA-a-nls反义基因植物表达载体,利用农杆菌介导法转化甜橙实生苗,经PCR检测,成功获得了9株转pthA-nls和12株转pthA-a-nls基因甜橙转基因苗,目前转基因苗长势良好。对9株转pthA-nls基因甜橙中的生长势好的3株进行Southern杂交分析,证明pthA-nls基因已成功整合到甜橙基因组中,通过RT-PCR对这3株转基因植株进行表达分析,检测到了外源目的基因的表达。以溃疡病菌液接种转pthA-nls基因和pthA-a-nls及对照甜橙植株离体叶片,接种试验结果表明,转pthA-nls基因植株叶片对溃疡病表现出一定的抗性,而转pthA-a-nls基因植株叶片对溃疡病表现与对照一样敏感。 4、采用PCR法扩增出pthA基因末端NLSs序列,并将其克隆到原核表达载体PET32a(+)的EcoRⅠ和XhoⅠ位点。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达重组蛋白,经Ni~(2+)-NTA纯化柱纯化得到纯化的重组蛋白,免疫Balb/c小白鼠,制备了相应的抗血清。Western blotting、ELISA鉴定结果表明,获得的抗血清可特异地结合重组蛋白亦可识别溃疡病菌PthA天然蛋白。利用抗血清与溃疡病菌混合接种离体冰糖橙叶片,发现抗血清对溃疡病的发生具有一定的拮抗作用,能推迟溃疡病菌的致病过程,且病斑比对照小,但未能达到抗病的程度。 5、制备了抗PthA-NLS重组多肽的3株单克隆抗体(McAb),McAb能够特异性、高亲和力地与PthA-NLS多肽结合。这3株McAb可被进一步用于柑橘溃疡病的鉴定检测,并为下一步制备单链抗体的研究提供杂交瘤细胞株。 6、通过RT-PCR成功地扩增出重链可变区基因和轻链可变区基因,采用重叠延伸PCR将两个可变区基因串联,获得的单链抗体基因大小约750 bp,将其克隆到T载体和原核表达载体pET32a(+),通过酶切和PCR鉴定均获得了约750 bp大小的条带。测序结果显示,重链可变区基因有360 bp,轻链可变区基因有342 bp,中间连接肽基因45 bp,经过IPTG诱导ScFv原核表达,获得了大小为44.5 KD的ScFv重组蛋白。 7、将ScFv基因构建到植物表达载体pBI121中,利用农杆菌介导法转化甜橙实生苗,经PCR检测,成功获得了12株转ScFv基因甜橙,利用RT-PCR分析外源基因ScFv在转基因植株中的表达,初步表明外源基因ScFv已成功转入到甜橙基因组中,并能在甜橙体内正常表达。采用离体接种对部分转ScFv基因植株进行抗性筛选,结果表明,转基因植株对溃疡病表现出一定的抗性,株系之间抗性存在着差异,其中D9可能是很有希望的抗性材料。


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