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猪巨细胞病毒囊膜糖蛋白B重组抗原的研制及应用

李晶  
【摘要】: 猪巨细胞病毒感染(porcine cytomegalovirus infection,PCMVI)是由疱疹病毒科β疱疹病毒亚科的猪巨细胞病毒(porcine cytomegalovirus,PCMV)引起的一种条件性传染病。该病自从1955年首次在英国发现以来,在猪群中流行甚广,凡饲养猪只的地区,猪群都有可能感染本病毒。欧洲、北美、和日本PCMV的血清抗体阳性率为90%以上,在感染猪群中,98%的猪只血清抗体为阳性。 根据GenBank登录的猪巨细胞病毒gB基因序列设计检测引物和全长gB基因引物,对来自湖南和江西不同地区的鼻拭子样品进行PCR检测,60.78%(31/51)的临床样品能扩增出260bp的目的条带。以阳性样品为模板扩增到全长gB基因,将其克隆到pMD-18T载体,核苷酸序列测定和分析结果表明所获得PCMVgB基因序列全长2580bp,编码860个氨基酸,与国外PCMV分离株的核苷酸同源性为97.6%-98.9%之间,氨基酸同源性为97%-98.6%之间;根据进化树分析,PCMV分为2大群,一群为中国湖南株、英国株和德国株,并命名为A群,另一群为日本株、瑞士株和西班牙株,并命名为B群。根据抗原表位优势、亲水性、表面可及性预测PCMVgB蛋白是理想的免疫学抗原候选蛋白。 gB是猪巨细胞病毒(PCMV)重要的结构蛋白,根据GenBank登录的猪巨细胞病毒gB基因序列设计一对引物,直接采用PCR扩增得到gB基因片段,将扩增出的片段克隆到pMD-18T载体并进行核苷酸序列测定。利用DNAStar分析gB蛋白的抗原表位,选择抗原表位富集的2个基因片段(命名为:PCMVgB1和PCMVgB2)分别克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建成融合表达质粒并转化Rosetta(DE3)宿主菌。结果显示:扩增的gB基因与GenBank登录的猪巨细胞病毒gB基因的核甘酸同源性在97.6%-98.9%之间,推导的氨基酸同源性在97%-98.6%之间。经IPTG诱导的含pETPCMVgB1和pETPCMVgB2重组质粒的宿主菌可表达gB1蛋白和gB2蛋白,SDS-PAGE显示分子量约为62kDa和36kDa。Western-blot和间接ELISA分析表明:gB1蛋白和gB2蛋白均具有反应原性。 为确定猪巨细胞病毒(PCMV)重组gB1蛋白作为检测抗原的实用性,将已构建成功的重组质粒pETPCMVgB1转入Rosetta(DE3)宿主菌进行诱导表达,以纯化的重组gB1蛋白作为包被抗原,建立了检测猪巨细胞病毒抗体的gB1-ELISA方法并对临床血清样品进行检测。结果显示,所获得重组gB1蛋白具有良好的抗原性和较高的灵敏度,且不与其他常见猪病的阳性血清发生交叉反应;我国不同省份猪群的平均阳性率为95.21%(657/690),美国进口猪群的阳性率为81.25%(26/32),为猪巨细胞病毒的血清流行病学调查奠定了基础。


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