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镉诱导仔猪睾丸支持细胞凋亡及机理研究

张明  
【摘要】: 镉作为机体生长发育非必需元素,少量进入体内即可通过生物放大和生物蓄积对肝、肾、肺、睾丸、脑、骨骼以及血液系统产生一系列损伤,镉进入身体后,分布于全身各个器官,睾丸是重要的代谢器官。镉的生殖毒性的研究大都是对生精细胞.但镉对睾丸支持细胞,特别是猪睾丸支持细胞毒性研究国内外罕见报道。本研究以体外培养的仔猪睾丸支持细胞为模型,采用形态学、生化及分子生物学方法,研究氯化镉诱导支持细胞氧化损伤、细胞凋亡及其机理,以期为镉的雄性生殖毒性的研究提供参考性资料。 1.支持细胞的分离、培养、鉴定、传代、冻存和复苏 采用二步酶解法分离后的支持细胞并用含15%FBS的DMEM/F12培养基培养,等到纯度较高的支持细胞。通过油红0和免疫细胞化学法鉴定。进行传代培养,再进行冻存复苏培养。为后续试验提供了试验材料。 2.氯化镉对支持细胞抑制率的影响 O、10、20、40及80μmol/L氯化镉分别作用支持细胞24 h后,采用MTT法观察氯化镉对细胞生长的影响。结果显示:随着给氯化镉剂量的增加,对细胞抑制作用增强,同对照组比较差异具有显著性,存在着剂量-效应关系。 2.氯化镉对支持细胞的氧化损伤作用 0、10、20、40及80μmol/L氯化镉分别作用支持细胞24 h后,利用生化方法检测其对细胞氧化损伤的情况。结果显示:随着氯化镉剂量的升高,SOD的活性降低,同对照组比较差异具有显著性;MDA含量逐渐增加,同对照组比较差异具有显著性;GSH-px的活性下降,各实验组与对照组比较差异有显著性。 3.氯化镉对支持细胞的DNA损伤作用 0、10、20、40及80 p mol/L氯化镉分别作用支持细胞24 h后,利用彗星试验检测其对细胞DNA损伤的情况。结果显示:随着氯化镉剂量的升高,支持细胞DNA损伤加重,存在着剂量-效应关系。 4.氯化镉对支持细胞超微结构的影响 0、10、20、40及80μmol/L氯化镉分别作用支持细胞24 h后,支持细胞超微结构发生病变,随着氯化镉剂量的升高有较重趋势。 5.氯化镉对支持细胞凋亡的影响 0、10、20、40及80μmol/L氯化镉分别作用支持细胞24 h后, AO/EB双荧光标记,荧光显微镜观察细胞。不同剂量组均有凋亡细胞出现。正常细胞的细胞核DNA呈绿色荧光,核饱满;出现凋亡的细胞可见细胞体积缩小,细胞呈黄绿色,形状不规则,细胞膜粗糙,部分细胞呈鲜亮的橙色斑点,随着药物浓度的增加,细胞数量明显减少,并出现坏死细胞,细胞体积增大,胞质内黄绿色或桔黄色荧光减弱甚至消失,可见红染细胞。随着剂量的增加,各实验组细胞凋亡率升高。采用FITC-AnnexinV/PI双荧光标记,流式细胞术检测细胞凋亡的变化。结果显示:各实验组均观察到明显的细胞凋亡,同对照组比较差异具有显著性,并随着剂量的升高凋亡率增加。 6氯化镉对支持细胞线粒体电位膜的影响 0、10、20、40及80μmol/L氯化镉分别作用支持细胞24 h后,罗丹明123染色,荧光显微镜和荧光分光光度计检测:氯化镉能促使线粒体膜电位降低,随着氯化镉作用浓度的增加,弱荧光部分细胞含量逐渐增高。 6. RT-PCR法检测Bax, Bcl-2, CytC, AIF, Caspase-9和Caspase-3 mRNA水平表达变化 采用RT-PCR方法检测氯化镉作用支持细胞24 h后细胞Bax,Bcl-2, CytC, AIF, Caspase-9和Caspase-3 mRNA水平的变化。结果显示:随着给氯化镉剂量的增加,bcl-2的基因表达呈现降低的趋势,其余各基因表达呈增加趋势。说明bcl-2基因有抑制凋亡的作用,其余基因有促进凋亡的作用。 7. Western blot法检测Bax,Bcl-2, CytC, AIF, Caspase-9和Caspase-3的蛋白水平的变化 采用Western blot检测检测氯化镉作用支持细胞24 h后细胞Bax,Bcl-2,CytC, AIF, Caspase-9和Caspase-3蛋白水平的变化。结果显示:随着给氯化镉剂量的增加,bcl-2的蛋白表达呈现降低的趋势,其余各基因蛋白表达呈增加趋势。


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