收藏本站
收藏 | 论文排版

双生病毒外壳蛋白和传毒相关蛋白基因介导的病毒抗性研究

唐前君  
【摘要】: 双生病毒在世界范围内广泛发生,严重危害多种重要经济作物。近年来,随着B型烟粉虱的入侵和扩散,番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)在我国番茄产区不断蔓延传播且逐年加重,在部分地区大面积爆发,危害严重,难以防治,对农业生产构成严重的威胁。近年发展起来的RNA沉默(RNA silencing)技术可能是解决此问题的有效途径之一 本研究以中国番茄黄化曲叶病毒Y10外壳蛋白2个不同氨基酸同源性150bp左右短片段和3个不同长度的外壳蛋白基因片段构建dsRNA植物表达载体,转化烟草和番茄,以求获得抗性强、抗性范围广的抗病转基因植株,并试图找出能诱导RNA介导的病毒抗性的最佳片段;同时,以B型烟粉虱传毒相关蛋白GroEL基因片段构建dsRNA植物表达载体,并转化烟草和番茄,探索利用RNAi切断病毒传播途径的可能性。本论文的研究为进一步构建双价基因,从病毒侵染和介体传毒两条途径切断双生病毒的侵染和流行,建立双生病毒分子调控技术体系打下基础。研究的结果和主要结论如下: 1、利用中国番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV)的CP基因片段构建dsRNA转化本氏烟和番茄及其抗病性研究 1.1不同氨基酸同源性CP基因片段dsRNA介导的抗病性研究 对大部分TYLCV的CP基因序列与TYLCCNV的CP的基因序列进行氨基酸同源性比对,分别选取同源性为94.94%的159bp的CP片段和81.32%的158bp的CP片段,成功构建含CP片段的dsRNA植物表达载体pBIN19-2HCP和pBIN19-2LCP,以本氏烟和番茄Moneymaker为转基因材料,通过农杆菌介导法分别将基因转入烟草和番茄中,得到含2HCP的转基因烟草56株、转基因番茄59株;得到含2LCP的转基因烟草43株、转基因番茄61株。通过对TO代扩繁株攻毒实验后表型观察和PCR检测发现,来自同一母株的TO代扩繁株抗性完全一致,转低同源CP片段dsRNA的转基因本氏烟TO代植株抗病型的比率为47.1%,而转高同源CP片段dsRNA的转基因本氏烟TO代植株抗病型的比率为72.7%。 1.2不同长度CP基因片段dsRNA介导的抗病性研究 分别选取长度约为150bp、300bp和450bp的CP片段,成功构建CP片段dsRNA植物表达载体pBIN19-2CP159(即pBIN19-2HCP)、pBIN19-2CP302和pBIN19-2CP457,以本氏烟和番茄Moneymaker为转基因材料,通过农杆菌介导法将基因转入烟草和番茄中,分别得到含2CP159、2CP302和2CP457转基因烟草56株、57株和38株,转基因番茄植株59株、77株和54株。通过对T0代扩繁株攻毒实验后表型观察和PCR检测发现,来自同一母株的T0代扩繁株抗性完全一致;但转3个不同长度CP片段dsRNA的转基因本氏烟T0代植株抗病性存在差异,分别为72.7%、80.7%和89.6%。我们从转pBIN19-2CP159 T0代转基因烟草抗病植株中随机选取4株繁殖,进行T1代抗病性分析,结果发现T1代植株抗病株比率分别为12.5%、22.5%、10.0%和17.5%。 2、利用B型烟粉虱GroEL基因片段构建dsRNA转化本氏烟和番茄干扰烟粉虱传毒的研究 随机选取长度约为300和500bp的GroEL基因片段,成功构建GroEL基因片段dsRNA植物表达载体pBIN19-2G502和pBIN19-26306。以本氏烟和番茄Moneymaker为转基因材料,通过农杆菌介导的转基因策略将基因转入并整合到烟草和番茄中,分别得到转基因烟草73株和46株,转基因番茄91株和66株;农杆菌介导的植株接种和烟粉虱传毒的接种方法对T0代扩繁株攻毒实验,表型观察和PCR检测结果表明,来自同一母株的T0代扩繁株抗性完全一致,转2个不同长度GroEL基因片段dsRNA的转基因本氏烟T0代中没有发现抗病型植株,两种不同接种方法所得的耐病型比率有一定差别,前一种接种方法得到的耐病型比率分别为56.6%和57.0%,而后一种接种方法得到的耐病型比率则分别为69.9%和65.0%。将带毒并在TO代转基因烟草扩繁株取食2天后的烟粉虱取食非转基因植株,通过PCR检查发现,转含26502和26306的转基因植株对烟粉虱的传毒能力干扰率分别为22.0%和16.0%。 3在本氏烟中瞬时表达TYLCCNV CP基因dsRNA的抗病性初步分析 为了初步确定TYLCCNV CP基因dsRNA能否诱导病毒抗性,减少基因操作的盲目性,我们构建植物表达载体pBIN19-GFP和pBIN19-CP-GFP,瞬时表达本氏烟,均可见GFP荧光。预先渗入pBIN19- 2CP457植物表达载体,然后再瞬时表达pBIN19-GFP和pBIN19-CP-GFP,前者GFP正常表达,而后者GFP荧光不可见;或渗入实验后16天用TYLCCNV Y10农杆菌侵染性克隆进行再接种,处理植株均表现为免疫。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 周雪平,李德葆;卫星病毒和卫星RNA的分子结构及遗传工程[J];中国生物工程杂志;1993年06期
2 杨兴洪,吴晓东,张连忠,冷强;花叶病毒与植物相互作用的分子生物学[J];植物生理学通讯;1997年02期
3 李利君,周仲驹,谢联辉;甘蔗花叶病毒3’末端基因的克隆及外壳蛋白序列分析比较[J];中国病毒学;2001年01期
4 陈梅;邱德文;刘峥;杨秀芬;曹克强;;植物激活蛋白对烟草花叶病毒RNA复制及外壳蛋白合成的抑制作用[J];中国生物防治;2006年01期
5 窦敏;张国广;于广福;张红心;沈明山;陈亮;;含口蹄疫病毒IRES RNA病毒样颗粒表达载体的构建[J];中国生物工程杂志;2007年09期
6 吴艳兵;谢荔岩;谢联辉;林奇英;;毛头鬼伞多糖CCP60a对TMV外壳蛋白的影响[J];植物资源与环境学报;2008年03期
7 马铮,李巧丽,宋任涛,许政暟;外壳蛋白羧端序列缺失对烟草花叶病毒侵染性的影响[J];病毒学报;2005年04期
8 张永江;李明福;相宁;李桂芬;;小西葫芦黄花叶病毒北京分离物的鉴定及其基因组3′端特性分析[J];植物保护学报;2006年01期
9 兰玉菲;刘金亮;高瑞;王红艳;朱天生;竺晓平;李向东;;烟草脉带花叶病毒cp基因的原核表达及抗血清制备[J];植物病理学报;2007年05期
10 李晶晶;邓召花;曾静;张金方;张飞云;;侵染万寿菊的黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与序列分析[J];生物技术通报;2007年06期
11 洪益国,裴美云,王小凤,田波,刘力,陈声祥;水稻条纹叶枯病毒分子生物学的研究——外壳蛋白分子量、氨基酸组成和N末端[J];科学通报;1990年16期
12 叶荣,于善谦,韦石泉;用单克隆抗体作芜菁花叶病毒不同分离物外壳蛋白抗原结构的比较研究[J];病毒学报;1996年01期
13 夏光敏,陈惠民,郭光沁,成卓敏,吴茂森;微弹射击将大麦黄矮病毒外壳蛋白基因转入小麦获可育植株[J];山东大学学报(自然科学版);1996年01期
14 孙世琪;刘湘涛;郭慧琛;尹双辉;刘在新;马军武;谢庆阁;;猪水疱病病毒外壳蛋白的二级结构和抗原表位预测[J];中国生物工程杂志;2006年05期
15 马铮;李巧丽;;缺失外壳蛋白羧端155-158序列对TMV侵染性的影响[J];湖北农业科学;2008年08期
16 王璋瑜;;艾滋病疫苗的临床试验展示曙光[J];生物技术通报;1991年03期
17 王钧,俞德超,柳念祖;从带烟草花叶病毒外壳蛋白亚基因组启动子的负链RNA产生正链RNA[J];病毒学报;1996年03期
18 曹云鹤;原雪峰;王晓星;郭立华;蔡祝南;韩成贵;李大伟;于嘉林;;甜菜黑色焦枯病毒外壳蛋白与病毒致病性的关系[J];生物化学与生物物理进展;2006年02期
19 李向阳;陈卓;杨松;宋宝安;;分子靶标烟草花叶病毒外壳蛋白的结构生物学研究进展[J];农药学学报;2010年04期
20 朱慧慧,巫爱珍,王鸣岐,孙玉昆;长叶车前花叶病毒上海分离株(HRVsh)外壳蛋白免疫多肽的研究[J];病毒学报;1987年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 武改霞;黄娜;杨帅;孙现超;青玲;;温州蜜柑萎缩病毒小外壳蛋白的原核表达与纯化[A];公共植保与绿色防控[C];2010年
2 颜瑾;朱亚峰;丸山稚子;大村敏博;;植物呼肠孤病毒外壳蛋白与昆虫传毒机制的研究进展[A];生命科学与生物技术:中国科协第三届青年学术年会论文集[C];1998年
3 Ida Bagus Andika;孙丽英;孙炳剑;陈剑平;;中国小麦花叶病毒外壳蛋白的翻译策略与小麦品种抗病性相关[A];中国植物病理学会2010年学术年会论文集[C];2010年
4 张建新;吴云锋;;西瓜花叶病毒外壳蛋白和辅助蛋白与介体蚜虫体内相关蛋白的相互作用[A];中国植物病理学会2008年学术年会论文集[C];2008年
5 马晓东;李重九;;用质谱法研究烟草花叶病毒外壳蛋白[A];中国质谱学会第七届会员代表大会暨学术报告会论文集[C];2004年
6 邱德义;杨雷亮;岳巧云;管维;王章根;陈定虎;;李痘病毒CP基因在大肠杆菌中的表达、纯化及其抗血清制备[A];中国植物病理学会2008年学术年会论文集[C];2008年
7 卢航;王文霞;尹恒;赵小明;杜昱光;;壳寡糖对烟草花叶病毒的体外钝化[A];植物保护科技创新与发展——中国植物保护学会2008年学术年会论文集[C];2008年
8 ;大麦黄矮病毒埃及PAV株系外壳蛋白和聚合酶(ORF1)基因的克隆测序及序列比较[A];第三次全国植物病毒和病毒防治学术研讨会论文集[C];2003年
9 李江;李旻;李大伟;韩成贵;于嘉林;;烟草坏死病毒A的外壳蛋白基因在致病性中的功能研究[A];中国植物病理学会2008年学术年会论文集[C];2008年
10 周国辉;陈晓琴;李华平;李梅辉;周洁浪;唐添华;冯盛祥;郭丽晶;;侵染广东兰花的建兰花叶病毒分子鉴定及其外壳蛋白基因序列分析[A];第三次全国植物病毒和病毒防治学术研讨会论文集[C];2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张晓峰;芜菁邹缩病毒复制酶小亚基P28在重复侵染排斥中的功能研究[D];中国农业大学;2013年
2 刘小红;玉米矮花叶病抗性的分子机理研究[D];四川农业大学;2005年
3 郑银英;苹果茎沟病毒和褪绿叶斑病毒分子变异研究[D];华中农业大学;2005年
4 江陆斌;以烟草花叶病毒为载体在植物中表达外源多肽的研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2003年
5 黄大辉;抗病小麦中与大麦黄矮病毒CP蛋白和RdRp复制酶相互作用蛋白的研究[D];中国农业科学院;2007年
6 李巧丽;烟草花叶病毒载体及其在植物中表达外源多肽的研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2004年
7 林董;RSV五个基因及GFP-CP、GFP-SP融合基因在sf9昆虫细胞中的表达[D];福建农林大学;2007年
8 王彩霞;柑橘衰退病毒的血清学特性分析及其诱导寄主差异表达基因的筛选[D];华中农业大学;2007年
9 崔红光;李属坏死环斑病毒遗传多样性分析和致病相关基因鉴定[D];华中农业大学;2013年
10 蒋军喜;玉米矮花叶病病原鉴定、检测及外壳蛋白基因变异研究[D];浙江大学;2002年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 乔艳艳;烟草环斑病毒检测及其cp基因片段原核表达[D];西北农林科技大学;2008年
2 陈梅;植物激活蛋白对烟草花叶病毒(TMV)的生物活性及作用机理初探[D];河北农业大学;2005年
3 刘晓玲;PVX 25kD运动蛋白基因和外壳蛋白基因介导的抗病性研究[D];山东农业大学;2005年
4 黄冲;李属坏死环斑病毒CN-Huairou分离物的初步研究及种苗传毒风险模拟评估[D];中国农业大学;2005年
5 孙博;大麦黄矮病毒群体的分子变异[D];中国农业科学院;2006年
6 刘科宏;柑桔碎叶病毒实时荧光RT-PCR检测技术及八种柑桔类植物对其变异影响的研究[D];西南大学;2009年
7 魏广彪;马铃薯卷叶病毒的分子鉴定与检测技术[D];福建农林大学;2005年
8 李燕;百合无症病毒的RT-PCR和核酸杂交检测及其外壳蛋白在大肠杆菌中的表达[D];西北农林科技大学;2005年
9 薛杨;葡萄几种病毒多重PCR检测和ArMV外壳蛋白的表达及抗血清制备[D];西北农林科技大学;2006年
10 王信;青海蚕豆、豌豆病毒病调查和菜豆黄花叶病毒(BYMV)全系列分析[D];西北农林科技大学;2007年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 晓荻;西尼罗河病毒外壳蛋白[N];医药经济报;2002年
2 曾耀英;HIV疫苗 研究思路[N];中国中医药报;2006年
3 邹先彪;消毒谨防过敏和灼伤[N];保健时报;2003年
4 叶常生;何为乙肝“两对半”[N];医药养生保健报;2004年
5 刘飞;南非尝试“种植”癌症疫苗[N];中国医药报;2004年
6 李彬;南非尝试“种植”癌症疫苗[N];科技日报;2004年
7 ;乙肝两对半的临床意义[N];保健时报;2008年
8 基因潮;美国默克公司进行预防HIV的临床试验[N];中国高新技术产业导报;2002年
9 《三联生活周刊》供稿;追查冠状病毒[N];医药经济报;2003年
10 通讯员  罗倩 记者  彭德倩;基因疫苗抵挡口蹄疫[N];解放日报;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978