双生病毒外壳蛋白和传毒相关蛋白基因介导的病毒抗性研究

【摘要】： 双生病毒在世界范围内广泛发生,严重危害多种重要经济作物。近年来,随着B型烟粉虱的入侵和扩散,番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)在我国番茄产区不断蔓延传播且逐年加重,在部分地区大面积爆发,危害严重,难以防治,对农业生产构成严重的威胁。近年发展起来的RNA沉默(RNA silencing)技术可能是解决此问题的有效途径之一 本研究以中国番茄黄化曲叶病毒Y10外壳蛋白2个不同氨基酸同源性150bp左右短片段和3个不同长度的外壳蛋白基因片段构建dsRNA植物表达载体,转化烟草和番茄,以求获得抗性强、抗性范围广的抗病转基因植株,并试图找出能诱导RNA介导的病毒抗性的最佳片段；同时,以B型烟粉虱传毒相关蛋白GroEL基因片段构建dsRNA植物表达载体,并转化烟草和番茄,探索利用RNAi切断病毒传播途径的可能性。本论文的研究为进一步构建双价基因,从病毒侵染和介体传毒两条途径切断双生病毒的侵染和流行,建立双生病毒分子调控技术体系打下基础。研究的结果和主要结论如下： 1、利用中国番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV)的CP基因片段构建dsRNA转化本氏烟和番茄及其抗病性研究 1.1不同氨基酸同源性CP基因片段dsRNA介导的抗病性研究 对大部分TYLCV的CP基因序列与TYLCCNV的CP的基因序列进行氨基酸同源性比对,分别选取同源性为94.94%的159bp的CP片段和81.32%的158bp的CP片段,成功构建含CP片段的dsRNA植物表达载体pBIN19-2HCP和pBIN19-2LCP,以本氏烟和番茄Moneymaker为转基因材料,通过农杆菌介导法分别将基因转入烟草和番茄中,得到含2HCP的转基因烟草56株、转基因番茄59株；得到含2LCP的转基因烟草43株、转基因番茄61株。通过对TO代扩繁株攻毒实验后表型观察和PCR检测发现,来自同一母株的TO代扩繁株抗性完全一致,转低同源CP片段dsRNA的转基因本氏烟TO代植株抗病型的比率为47.1%,而转高同源CP片段dsRNA的转基因本氏烟TO代植株抗病型的比率为72.7%。 1.2不同长度CP基因片段dsRNA介导的抗病性研究 分别选取长度约为150bp、300bp和450bp的CP片段,成功构建CP片段dsRNA植物表达载体pBIN19-2CP159(即pBIN19-2HCP)、pBIN19-2CP302和pBIN19-2CP457,以本氏烟和番茄Moneymaker为转基因材料,通过农杆菌介导法将基因转入烟草和番茄中,分别得到含2CP159、2CP302和2CP457转基因烟草56株、57株和38株,转基因番茄植株59株、77株和54株。通过对T0代扩繁株攻毒实验后表型观察和PCR检测发现,来自同一母株的T0代扩繁株抗性完全一致；但转3个不同长度CP片段dsRNA的转基因本氏烟T0代植株抗病性存在差异,分别为72.7%、80.7%和89.6%。我们从转pBIN19-2CP159 T0代转基因烟草抗病植株中随机选取4株繁殖,进行T1代抗病性分析,结果发现T1代植株抗病株比率分别为12.5%、22.5%、10.0%和17.5%。 2、利用B型烟粉虱GroEL基因片段构建dsRNA转化本氏烟和番茄干扰烟粉虱传毒的研究 随机选取长度约为300和500bp的GroEL基因片段,成功构建GroEL基因片段dsRNA植物表达载体pBIN19-2G502和pBIN19-26306。以本氏烟和番茄Moneymaker为转基因材料,通过农杆菌介导的转基因策略将基因转入并整合到烟草和番茄中,分别得到转基因烟草73株和46株,转基因番茄91株和66株；农杆菌介导的植株接种和烟粉虱传毒的接种方法对T0代扩繁株攻毒实验,表型观察和PCR检测结果表明,来自同一母株的T0代扩繁株抗性完全一致,转2个不同长度GroEL基因片段dsRNA的转基因本氏烟T0代中没有发现抗病型植株,两种不同接种方法所得的耐病型比率有一定差别,前一种接种方法得到的耐病型比率分别为56.6%和57.0%,而后一种接种方法得到的耐病型比率则分别为69.9%和65.0%。将带毒并在TO代转基因烟草扩繁株取食2天后的烟粉虱取食非转基因植株,通过PCR检查发现,转含26502和26306的转基因植株对烟粉虱的传毒能力干扰率分别为22.0%和16.0%。 3在本氏烟中瞬时表达TYLCCNV CP基因dsRNA的抗病性初步分析 为了初步确定TYLCCNV CP基因dsRNA能否诱导病毒抗性,减少基因操作的盲目性,我们构建植物表达载体pBIN19-GFP和pBIN19-CP-GFP,瞬时表达本氏烟,均可见GFP荧光。预先渗入pBIN19- 2CP457植物表达载体,然后再瞬时表达pBIN19-GFP和pBIN19-CP-GFP,前者GFP正常表达,而后者GFP荧光不可见；或渗入实验后16天用TYLCCNV Y10农杆菌侵染性克隆进行再接种,处理植株均表现为免疫。